《Frontiers in Microbiology》：ROS-implicated apoptosis in Candida albicans: mechanistic insights into Aureobasidin A's antifungal activity
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本文系统阐述Aureobasidin A（AbA）通过抑制鞘脂合成酶（IPC synthase）和激活活性氧（ROS）介导的线粒体凋亡双重机制，有效抑制白色念珠菌（C. albicans）生长及其毒力因子（生物膜形成、菌丝转化等）。研究通过转录组测序（RNA-seq）验证氧化应激通路关键基因（TSA1、CAT1等）下调，并利用小鼠口腔念珠菌病模型证实局部应用AbA可显著降低真菌负荷（80%）和组织炎症（60%），为抗唑类耐药感染提供新型多机制治疗策略。
引言
天然产物因其结构多样性和生物特异性成为抗真菌药物的重要来源。Aureobasidin A（AbA）是一种源自出芽短梗霉的环状脂肽抗生素，其已知的主要作用机制是通过特异性抑制鞘脂生物合成中的关键酶——肌醇磷酸神经酰胺（IPC）合酶，破坏膜完整性。值得注意的是，AbA介导的IPC合酶抑制还能干扰膜定位的ABC外排泵功能，这些泵是白色念珠菌唑类耐药的主要介质。然而，AbA抗真菌作用的完整谱系，特别是其诱导程序性细胞死亡的潜力以及治疗口腔念珠菌病的疗效，仍未得到充分探索。
细胞凋亡作为一种程序性细胞死亡形式，其特点包括细胞皱缩、染色质凝集和DNA片段化。它可以通过内在线粒体或外源性死亡受体途径启动。内在线粒体途径通常由细胞应激引发，导致线粒体外膜透化、细胞色素c释放和半胱天冬酶蛋白酶激活。值得注意的是，真菌包括白色念珠菌拥有基本的凋亡机制，可被外部刺激激活，这为抗真菌药物开发提供了新靶点。
线粒体是这种内在凋亡的核心调节器。除了在能量生产中的作用外，它们还是活性氧的主要来源。过量的ROS积累会导致氧化损伤，引起线粒体功能障碍、线粒体膜电位丧失和促凋亡因子释放，从而启动半胱天冬酶依赖性凋亡级联反应。这种ROS介导的凋亡越来越被认为是几种抗真菌药物的关键作用机制。
鉴于AbA对膜脂质的已知作用可能产生继发性氧化应激，我们假设ROS介导的线粒体凋亡可能参与其抗真菌功效。迄今为止，尽管AbA在体外具有强大的抗真菌活性，但尚未被批准用于临床治疗口腔念珠菌病。本研究旨在系统研究AbA的这一新机制。
材料与方法
本研究独家使用标准野生型白色念珠菌菌株SC5314。通过表型测定、转录谱分析和分子分析，我们描绘了AbA如何诱导白色念珠菌中ROS积累、线粒体损伤和随后的凋亡。此外，我们在小鼠口腔念珠菌病模型中评估了AbA的体内治疗效果。
抗真菌功效评估显示，AbA对白色念珠菌SC5314的最低抑菌浓度（MIC）为0.0625 μg/mL。时间杀菌动力学试验证明了AbA的强大杀菌活性。浓度≥ 2 × MIC（0.125 μg/mL）的处理导致菌落形成单位（CFU）进行性、时间依赖性减少，4 × MIC和8 × MIC在12小时内实现近乎完全根除。
AbA显著损害了与生物膜相关的致病性。结晶紫染色显示，低至2 × MIC的浓度即可剂量依赖性地抑制早期生物膜形成。同时，细胞外聚合物（EPS）的产生也随之减少，这对于生物膜基质完整性至关重要。此外，AbA处理显著减弱了白色念珠菌对宿主L929细胞的粘附能力。从酵母到菌丝的形态转变是白色念珠菌毒力的基石，被AbA深刻抑制。
结果
AbA表现出强大的抗真菌活性并抑制毒力因子
AbA对白色念珠菌SC5314的MIC确定为0.0625 μg/mL。时间杀菌动力学试验证明了AbA的强大杀菌活性。浓度≥ 2 × MIC的处理导致CFU进行性、时间依赖性减少。AbA显著损害了生物膜相关的致病性，剂量依赖性地抑制早期生物膜形成和EPS产生，并显著减弱菌丝形成和粘附能力。
AbA损害细胞膜完整性和超微结构
结晶紫摄取试验表明，用8 × MIC AbA处理显著增加了染料吸收，表明膜通透性增强和细胞壁完整性受损。扫描电子显微镜提供了超微结构损伤的视觉证据。经AbA处理的细胞显示出广泛的表面皱缩、塌陷，并且几乎完全缺乏菌丝结构。PI染色进一步证实了膜损伤，随着AbA浓度的增加，PI荧光强度也增加，表明膜完整性呈剂量依赖性丧失。重要的是，细胞相容性测定结果显示，在测试浓度下，AbA对哺乳动物L929成纤维细胞没有显著的细胞毒性作用。
AbA诱导氧化应激并与细胞凋亡相关
我们假设AbA诱导的膜损伤可能导致细胞内ROS积累，引发凋亡。DCFH-DA染色证实，AbA处理后细胞内ROS水平显著、剂量依赖性增加。随后我们研究了这种ROS爆发是否能在成熟生物膜内诱导凋亡。共聚焦显微镜分析显示，8 × MIC AbA处理显著降低了生物膜活力和厚度，死细胞与活细胞的比例显著增加，证明了强大的抗生物膜活性。
转录组学和分子分析证实凋亡激活
AbA处理细胞的RNA测序分析揭示了显著的转录重编程。差异表达基因的基因本体富集分析显示，与氧化应激反应相关的过程显著下调。qRT-PCR验证证实了关键氧化应激防御基因的剂量依赖性下调。使用Annexin V-FITC/PI染色的流式细胞术分析提供了凋亡的直接证据。AbA处理导致早期和晚期凋亡细胞群显著、浓度依赖性增加。使用JC-1染色检测到线粒体膜电位丧失，这是内在凋亡的关键事件。经AbA处理的细胞显示出从红色到绿色荧光的显著转变，表明MMP崩溃。TUNEL测定证实了AbA处理细胞中DNA片段化的发生——凋亡的终末阶段。
局部应用AbA改善体内口腔念珠菌病
在小鼠口腔念珠菌病模型中评估了AbA的治疗效果。宏观检查显示，载体处理的小鼠出现广泛的白斑和显著的舌水肿。相比之下，局部用AbA治疗的小鼠斑块面积显著减少，炎症迹象极小。舌匀浆的定量培养显示，与载体对照组相比，AbA治疗组小鼠的真菌负荷显著降低。组织病理学分析进一步支持了这些发现。
讨论
唑类耐药白色念珠菌菌株的日益流行凸显了对具有新作用机制的抗真菌药物的迫切需求。虽然AbA抑制IPC合酶已有充分记载，但本研究揭示了涉及ROS参与线粒体凋亡的潜在次要机制。这项工作显著增进了我们对AbA多药理学特性及其作为抗毒力和促凋亡剂潜力的理解，特别是对于口腔念珠菌病的治疗。
作为真菌鞘脂生物合成中的限速酶，IPC合酶对于维持真菌细胞膜的脂质组成、流动性和结构完整性至关重要。通过抑制IPC合酶，AbA最初破坏了鞘脂稳态。这种破坏不仅损害了真菌细胞膜的结构基础，还干扰了膜定位转运蛋白的功能。这种膜扰动为激活次级凋亡途径创造了两个有利条件。首先，它增加了膜对AbA本身的通透性，促进了细胞内药物积累。其次，它降低了膜清除ROS的能力，并损害了线粒体外膜的稳定性，使得ROS积累和随后的线粒体功能障碍更可能发生。
随后，AbA触发的ROS爆发进一步放大了细胞损伤。氧化应激不仅直接氧化DNA、蛋白质和脂质，还下调抗氧化基因的表达，形成“ROS放大环”，加速线粒体去极化和凋亡。通过靶向两个遗传和功能上独立的途径，这种双重机制使得真菌通过单一突变事件产生耐药性的可能性降低。
我们的研究结果证实，AbA对白色念珠菌具有强大的、浓度依赖性的杀菌作用。更重要的是，我们证明AbA有效破坏了关键的毒力相关途径。它显著抑制菌丝形成——这是白色念珠菌组织侵袭和致病性的关键决定因素。此外，它还损害生物膜形成和粘附，这些特性对于建立持续性感染和介导抗菌药物耐药性至关重要。这种对毒力因素的多方面靶向表明，AbA不仅可以根除白色念珠菌，还可以预防难以治疗的感染的建立。
本研究的核心新发现是阐明了一条涉及AbA的潜在凋亡途径，其中ROS扮演了参与角色。我们提供了一条强有力的证据链支持ROS的参与。值得注意的是，这种机制对生物膜特别有效——这是临床抗真菌治疗中的一个主要挑战。
为了进一步阐明上述凋亡途径的因果关系，我们进行了靶向干预实验进行验证：N-乙酰半胱氨酸介导的ROS清除试验结果清楚地突出了ROS在AbA诱导的白色念珠菌凋亡中的参与作用。这些发现证实了NAC对ROS水平和凋亡率的调节作用，并表明该途径内存在潜在的调节层级——ROS积累可能是AbA触发细胞死亡的上游信号。
作为内在凋亡途径的核心事件，MMP崩溃是连接ROS积累和DNA片段化的关键中间节点。基于上述ROS是上游信号的发现，NAC恢复AbA损伤的MMP的能力表明，ROS介导的线粒体功能障碍不是随机的细胞损伤，而是AbA诱导凋亡中的一个靶向调节步骤。我们的结果表明，AbA可能利用这种相互作用形成一个正反馈环。
进入凋亡的终末阶段，我们发现NAC显著抑制AbA诱导的DNA片段化——这一发现进一步支持了ROS信号在凋亡执行阶段的下游调节作用。LDH释放测定为阐明AbA诱导的细胞死亡类型提供了关键证据。在AbA处理组未观察到显著的LDH释放——这是区分凋亡和坏死的核心特征。
局部应用AbA在免疫活性小鼠模型中显示出良好的体内疗效。真菌负荷和病理损伤的显著减少凸显了其用于局部应用的潜力。尽管模型中使用了高真菌接种量以确保强感染，但明确的治疗效果证明了AbA在复杂生物微环境中发挥作用的能力。
尽管有这些有希望的发现，但本研究有几个局限性。首先，仅使用了白色念珠菌SC5314菌株，限制了结果对其他临床分离株的普适性。其次，体内模型采用高接种剂量和免疫抑制条件，可能不能完全复现临床情况。第三，AbA的全身药代动力学和毒性特征仍然未知。此外，虽然局部AbA在小鼠口腔念珠菌病模型中有效，但临床转化需谨慎，需要额外的口腔黏膜毒性长期评估。第四，虽然药理学抑制指出了ROS的关键作用，但未来研究使用遗传工具以时间控制方式操纵ROS生成或清除，将有助于进一步阐明所提出的凋亡途径内的因果关系。
总之，本研究清楚地描绘了AbA诱导白色念珠菌凋亡的完整途径：AbA首先下调氧化应激防御系统，导致ROS积累；ROS然后介导线粒体膜电位崩溃，激活下游凋亡效应分子，并最终诱导DNA片段化。关键重要的是这种新发现的凋亡机制与AbA作为IPC合酶抑制剂的既定作用之间的协同效应。
总之，除了其充分表征的鞘脂合成抑制作用外，AbA还通过靶向必需的细胞过程并触发白色念珠菌的程序性细胞死亡来执行复杂的抗真菌策略。通过其诱导ROS介导的凋亡和抑制毒力特性的能力，AbA代表了一种有希望的多靶点治疗候选药物，适用于口腔和侵袭性耐药真菌感染。这项研究为AbA的进一步开发奠定了坚实的基础，并强调了诱导真菌凋亡是对抗耐药真菌感染的可行策略。
