《Frontiers in Immunology》：Glycosaminoglycan binding to soluble CX3CL1 impacts monocyte migration in vitro
编辑推荐：
本文揭示了CX3CL1（fractalkine）化学因子结构域（cdCX3CL1）与硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸皮肤素（DS）等糖胺聚糖（GAGs）的高亲和力结合（Kd值达纳摩尔级），并证实GAGs通过促进CX3CL1寡聚化及与受体CX3CR1形成三元复合物，显著增强单核细胞趋化活性。该研究为炎症性疾病（如动脉粥样硬化、类风湿关节炎）的靶向治疗提供了新视角。
引言
趋化因子是一类约50个成员的小分子可溶性蛋白，根据半胱氨酸残基位置分为C、CC、CXC和CX3C亚族。CX3CL1（fractalkine）是CX3C亚族唯一成员，以膜结合形式介导细胞间黏附，其可溶性形式（含黏蛋白样茎部和化学因子结构域cdCX3CL1）则通过G蛋白偶联受体CX3CR1促进单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞的定向迁移。糖胺聚糖（GAGs）作为细胞外基质（ECM）中高度硫酸化的多糖，常作为共受体参与趋化因子功能，但CX3CL1与GAGs的相互作用机制及其生物学意义尚不明确。
材料与方法
研究通过大肠杆菌表达系统重组制备cdCX3CL1，经三步色谱纯化后，通过胍盐酸诱导变性实验和圆二色谱验证蛋白结构完整性。采用等温荧光滴定（IFT）测定cdCX3CL1与GAGs（HS、DS、透明质酸HA）的结合亲和力，并通过Boyden小室实验分析单核细胞（原代及THP-1细胞系）的趋化反应。此外，利用甲醛交联实验和尺寸排阻色谱（SEC）探究CX3CL1-CX3CR1-HS三元复合物的形成及GAGs对蛋白寡聚化的影响。
结果
cdCX3CL1与GAGs的高亲和力结合
IFT实验显示cdCX3CL1与HS、DS结合Kd值分别为约200 nM和300 nM，与肝素结合力最强（Kd≈ 80 nM），非硫酸化HA亦呈现双相结合曲线，提示带电与非极性氨基酸均参与GAG识别。
HS调控CX3CL1寡聚化与单核细胞迁移
SEC表明HS可诱导cdCX3CL1形成分子量约16.1 kDa的复合物及更高级寡聚体。细胞实验发现，用肝素酶III（HepC）去除单核细胞表面HS后，cdCX3CL1介导的趋化指数下降50%，而外源性HS补充可恢复趋化活性。抗HS或抗CX3CR1抗体处理同样显著抑制细胞迁移，证实GAGs作为共受体协同CX3CR1信号传导。
GAG结合位点鉴定与功能验证
通过点突变（K54A/K59A）削弱cdCX3CL1与HS的结合力（Kd升至430 nM），其趋化活性降低57%，表明第54-59位氨基酸构成关键GAG结合域。
CX3CL1-CX3CR1-HS三元复合物的协同效应
交联实验显示cdCX3CL1与CX3CR1胞外段肽（pCX3CR1）形成稳定复合物，其与HS的结合亲和力提升近10倍（Kd= 28 nM），提示三元相互作用网络放大趋化信号。
讨论
本研究首次系统阐明CX3CL1通过特异性GAG结合域与HS/DS高亲和力相互作用，并揭示该相互作用在单核细胞迁移中的核心地位。GAGs不仅促进CX3CL1寡聚化，还通过与CX3CR1共定位形成三元复合物，优化趋化信号转导。这一机制拓展了对趋化因子-受体-共受体网络的理解，为靶向GAGs干预炎症性疾病（如动脉粥样硬化、肾病、肿瘤）提供了新策略。未来需进一步解析全长膜结合型CX3CL1的GAG相互作用模式及其在病理微环境中的动态调控。
