《Frontiers in Microbiology》：Metabolic response of Brevibacterium epidermidis TRM83610 to NaCl stress
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本研究采用代谢组学技术解析了耐盐菌株表皮短杆菌（Brevibacterium epidermidis）TRM83610在盐胁迫下胞内代谢物，特别是相容性溶质（compatible solutes）的动态变化，并利用响应面法（RSM）优化了其四氢嘧啶（ectoine）的发酵生产。研究发现菌株通过积累以ectoine为主的多种溶质，并采取渗透适应、抗氧化及竞争性生存等多层次策略响应盐胁迫，首次在该菌属中报道了Nε-乙酰-L-赖氨酸（Nε-acetyl-L-lysine）的存在。经发酵优化，ectoine产量提升6.22倍，达到440.60 mg/L，展示了其在绿色生物制造及工业应用中的潜力。
在第四代工业生物技术（NGIB）倡导绿色生物制造的背景下，利用嗜盐/耐盐微生物作为底盘细胞进行生物合成受到广泛关注。四氢嘧啶（ectoine）作为一种高价值的相容性溶质，在医药、化妆品和生物保护剂领域应用前景广阔。目前相关研究多集中于盐单胞菌属（Halomonas），而对其他潜在产ectoine菌属的探索有限。本研究旨在阐明从青藏高原茫崖翡翠湖分离的耐盐菌株表皮短杆菌（Brevibacterium epidermidis）TRM83610对氯化钠（NaCl）胁迫的代谢响应，并评估其ectoine生产能力。
为解析菌株的代谢响应，研究设置了0%、5%、10%和15%四个NaCl浓度梯度，通过非靶向代谢组学分析了胞内代谢物的变化。主成分分析（PCA）结果显示，不同盐度处理组间代谢谱存在显著差异，而组内样品变异较小，证明了实验的可靠性。研究共检测到1416种代谢物，主要分为有机杂环化合物、有机酸及其衍生物、苯环型化合物等九大类。随着NaCl浓度升高，含氧有机化合物的相对丰度逐渐降低，而苯环型化合物丰度逐渐增加，其余多数类别代谢物则呈现先升后降的趋势。层次聚类热图分析进一步表明，未加盐的对照组与所有加盐处理组（5%、10%、15% NaCl）的代谢谱明显区分，其中5%和10% NaCl处理组的代谢响应最为相似。
通过差异代谢物（DMs）分析发现，与对照组相比，10% NaCl胁迫下产生的DMs数量最多，表明菌株在此条件下代谢响应最为剧烈。KEGG富集分析揭示，ABC转运蛋白（ABC transporters）途径是盐胁迫下最显著富集的通路，其次是氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids）等与氨基酸代谢密切相关的通路。这些通路调节特定氨基酸的合成或降解，以满足盐胁迫下细胞对酸性物质的需求。
研究在显著富集的DMs中，鉴定出六种潜在的相容性溶质，分别为ectoine、甜菜碱（betaine）、L-谷氨酸（L-glutamic acid）、L-谷氨酰胺（L-glutamine）、Nε-乙酰-L-赖氨酸（Nε-acetyl-L-lysine）和L-脯氨酸（L-proline），其中ectoine的相对丰度最高。值得注意的是，Nε-乙酰-L-赖氨酸是首次在短杆菌属中被报道。这些溶质的丰度变化趋势各异：随着NaCl浓度增加，ectoine的丰度持续上升，在15% NaCl时达到峰值；Nε-乙酰-L-赖氨酸先升后降；而甜菜碱、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺和L-脯氨酸的丰度则逐渐下降。相关性分析显示，ectoine与14种有机酸及其衍生物、6种核苷及类似物呈强负相关，而与3种吲哚及其衍生物呈强正相关。在几种相容性溶质中，ectoine和Nε-乙酰-L-赖氨酸与甜菜碱、L-脯氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬氨酸（L-aspartic acid）呈负相关，而后几种溶质彼此之间则呈正相关。Nε-乙酰-L-赖氨酸与其他相容性溶质无显著相关性。
基于KEGG富集分析结果构建的代谢网络图阐明，这些相容性溶质通过多个代谢途径紧密互连。细胞通过ABC转运蛋白从外界摄取氨基酸。天冬氨酸是ectoine合成的底物，谷氨酸为ectoine生物合成提供氨基，并可转化为天冬氨酸作为补充来源。谷氨酰胺和脯氨酸可代谢生成谷氨酸以补充其库。赖氨酸代谢产生Nε-乙酰-L-赖氨酸，其经脱乙酰化可再生赖氨酸。赖氨酸的氧化降解最终生成琥珀酸进入三羧酸（TCA）循环。胆碱是甜菜碱合成的底物，甜菜碱可能转化为甘氨酸作为碳源，进而形成色氨酸。
通过靶向代谢组学（基于多反应监测MRM技术）对上述五种相容性溶质（不包括ectoine）进行定性与定量分析，确认了它们在菌株胞内的存在。定量结果与非靶向代谢组学揭示的丰度变化趋势一致：甜菜碱、L-脯氨酸、L-谷氨酸和L-谷氨酰胺的含量随NaCl浓度升高而逐渐降低；Nε-乙酰-L-赖氨酸含量在0-10% NaCl范围内增加，但在15% NaCl时急剧下降。同时，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）对比样品与ectoine标准品的保留时间和质荷比（m/z），确认了TRM83610能够合成ectoine。
为提升菌株的ectoine产量，研究采用响应面法（RSM）对发酵条件进行了系统优化。首先通过Plackett-Burman设计从八个因素中筛选出对ectoine产量有显著影响的复合盐浓度和培养基装液量。随后通过最陡爬坡实验逼近最优区域，确定中心点。最后，采用中心复合设计（CCD）进行优化，建立了ectoine产量（Y）与复合盐浓度（X4）和装液量（X5）的二次多项式回归模型。模型分析表明，在复合盐浓度110.20 g/L、装液量83.00 mL的优化条件下，预测ectoine产量最高。验证实验测得ectoine产量为440.60 mg/L，与预测值高度吻合，相较于初始产量70.75 mg/L提高了6.22倍。
综合代谢组学与发酵优化结果，研究揭示了表皮短杆菌TRM83610应对NaCl胁迫的多层次代谢策略。首先，菌株通过积累以ectoine为主的多种相容性溶质进行渗透适应（osmoadaptation）。研究提出一种“两阶段”耐盐策略假说：在胁迫初期，细胞可能快速积累甜菜碱、L-谷氨酸等易于获取的溶质以应对渗透压变化；随着时间推移，则转向合成ectoine等更为复杂的溶质，以实现长期的蛋白质稳定和保护。其次，代谢组学数据揭示了与抗氧化应激相关的代谢变化。例如，在高盐条件下，5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetate，血清素的氧化产物）的相对丰度升高，这可能有助于缓解氧化损伤。再者，研究在差异代谢物中注释到多种具有抗菌活性的次级代谢产物，表明菌株可能通过产生抗菌物质来增强其在复杂环境中的生存竞争力。
本研究初步评估了表皮短杆菌TRM83610的应用潜力。其野生型菌株经优化后ectoine产量达到440.62 mg/L，显示出强于许多已报道野生型菌株的生产能力。此外，菌株胞内丰富的相容性溶质谱，特别是首次在该属发现的Nε-乙酰-L-赖氨酸，以及代谢组学揭示的多种具有抗菌、抗炎和植物促生活性的代谢物，为其在生物制造、农业（作为植物促生细菌PGPB）和生物医药等领域的进一步开发和利用提供了新的代谢组学证据和理论依据。研究中还注释到一个通过机器学习鉴定的差异代谢物Azetidomonamide A，该化合物此前仅在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中有报道，并受群体感应（QS）调控，这暗示TRM83610可能也存在通过QS机制感知和响应环境变化的潜力，值得深入探究。
综上所述，表皮短杆菌TRM83610通过以ectoine合成为核心，协同抗氧化、抗菌等多重代谢策略，有效应对NaCl胁迫。该研究不仅丰富了该菌株的代谢图谱，初步揭示了其盐胁迫下的代谢适应机制，也通过发酵优化显著提升了其ectoine产量，为其发展成为工业生物技术中有价值的底盘细胞奠定了重要基础。
