NtLHT1基因调控烟草器官特异性代谢网络的整合转录组与代谢组学分析

《Frontiers in Plant Science》：Integrative transcriptomic and metabolomic analyses provide insights into the effects of overexpression and knockout of NtLHT1 in different tissues

本研究通过整合转录组学（RNA-seq）和代谢组学（UPLC-MS/MS）技术，系统解析了烟草Lysine-Histidine Transporter 1（NtLHT1）基因过表达（LHT1-OE）与敲除（LHT1-KO）对不同器官（根、茎、叶）代谢通路和基因表达的调控作用。研究发现NtLHT1作为"代谢枢纽"整合初级代谢（氨基酸转运）与次级代谢（生物碱、黄酮、萜类合成），并通过调节细胞分裂素（CTK）、生长素（IAA）和赤霉素（GA）通路介导器官特异性代谢重编程，为作物农艺性状改良提供新靶点。

Integrative transcriptomic and metabolomic analyses provide insights into the effects of overexpression and knockout of NttLHT1 in different tissues

1 Introduction

Lysine-Histidine Transporter 1（LHT1）是植物氨基酸转运的关键蛋白，参与营养吸收、叶片发育和非生物胁迫响应。尽管已在拟南芥、水稻等物种中鉴定LHT1同源基因，但烟草NtLHT1在不同器官中的调控机制仍不明确。本研究利用CRISPR/Cas9构建的NtLHT1敲除株系（LHT1-KO）、过表达株系（LHT1-OE）及野生型（LHT1-WT），通过多组学整合分析揭示其器官特异性调控网络。

2 Materials and methods

在烟草10叶期采集根、茎、叶样本，进行RNA-seq转录组测序和UPLC-MS/MS非靶向代谢组学分析。采用PCA、PLS-DA等统计方法评估代谢物与基因表达差异，并通过qRT-PCR验证关键基因表达。代谢物注释基于KEGG、HMDB等数据库，差异基因富集分析采用DESeq2算法。

3 Results

3.1 Disturbance of total metabolite content in various organs by NtLHT1 knockout and overexpression

PCA分析显示器官类型对代谢组和转录组的影响显著大于基因型差异。LHT1-OE引起更显著的代谢扰动：根中氨基酸衍生物、生物碱和玉米素合成通路上调；茎中苯丙烷类和萜类代谢增强；叶中黄酮类和萜类含量下降，伴随脂质积累增加。LHT1-KO仅引起氨基酸稳态轻微紊乱。

3.2 Differences and functional changes of metabolites in different organs induced by NtLHT1 knockout and overexpression

LHT1-OE在根、茎、叶分别引起285、579、289个差异代谢物变化。KEGG富集显示根中生物碱合成和玉米素 biosynthesis 通路上调，叶中半胱氨酸-蛋氨酸代谢和玉米素合成激活，而黄酮合成通路被抑制。核心扰动通路涉及芳香族氨基酸（Phe/Tyr/Trp）代谢和黄酮-黄酮醇生物合成。

3.3 Dynamic transcriptomic changes in various organs induced by NtLHT1 knockout and overexpression

转录组PCA与代谢组结果一致，器官间差异大于基因型间差异。LHT1-OE在叶中下调光合作用相关基因（如^TMN7、^SNAT2），在茎中上调苯丙烷合成基因，在根中激活碳代谢和氧化磷酸化通路。交叉分析鉴定出50个核心基因在器官间一致性调控。

3.4 NtLHT1 overexpression represses terpenoid metabolism and biosynthesis in leaves

LHT1-OE/KO均导致叶中萜类含量下降，包括3α-hydroxy-ent-kaurene、贝壳杉烯酸等。机制上，甲羟戊酸（MVA）途径关键基因^ACCT和萜类合酶基因^TPS表达受抑制，同时甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径基因^DXS、^FPPS下调，表明双通路被阻断。

3.5 NtLHT1 overexpression inhibits flavonoid metabolism and biosynthesis in leaves

LHT1-OE叶中93%的黄酮代谢物（如槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷）含量下降。苯丙烷合成通路结构基因（^PAL、^C4H、^CHS等）普遍下调，与前期发现的芳香族氨基酸前体减少相吻合。

3.6 NtLHT1 overexpression modulates phytohomone homeostasis by regulating IAA and cytokinin pathways in leaves

LHT1-OE通过调节苯丙烷代谢分支（降低IAA前体色胺、莽草酸）和腺苷代谢分支（增加CTK前体腺苷），导致CTK积累上升而IAA、GA含量下降。转录组验证了CTK相关基因（^CKX7、^ZOG）上调和IAA信号基因（^PIN1.3）表达改变。

4 Discussion

NtLHT1通过协调激素信号（CTK/IAA/GA）和次级代谢（黄酮、萜类）网络调控叶片形态建成。其"代谢枢纽"功能体现在三方面：介导氨基酸跨膜转运、影响激素前体供应、重构器官特异性代谢流。该研究为通过调控氨基酸转运蛋白改良作物株型和抗逆性提供了多组学证据支持。