《International Journal of Pharmaceutics》：Engineering lipid-coated silica nanoparticles as versatile adjuvant delivery platform for the TLR4 agonist MPLA
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脂质包覆固态和小孔径二氧化硅纳米颗粒（LC-SiNPs和LC-MSNs）作为模块化递送TLR4激动剂平台，通过贝叶斯优化显著提升免疫刺激效果（EC50降低至87 ng/mL），较传统单因素优化方法降低60 ng/mL，且巨噬细胞高效摄取和加工。该平台兼具脂质体的功能可调性和二氧化硅纳米粒子的尺寸均一性，未来可扩展用于其他TLR激动剂及抗原递送。
安德烈亚斯·G·施赖伯（Andreas G. Schreiber）|约翰内斯·康拉德（Johannes Konrad）|雷娜特·利布尔（Renate Liebl）|巴斯蒂安·贝茨inger（Bastian Beitzinger）|扬·克鲁蒂纳（Jan Krutina）|格雷戈尔·马德杰（Gregor Madej）|米卡·林登（Mika Lindén）|克里斯蒂娜·齐格勒（Christine Ziegler）|米里亚姆·布罗尼格（Miriam Breunig）
雷根斯堡大学制药技术系，Universitaetsstrasse 31，93053 雷根斯堡，德国
摘要
本研究开发了脂质包覆的固体和介孔二氧化硅纳米颗粒（LC-SiNPs 和 LC-MSNs），作为递送Toll样受体（TLR）激动剂的模块化平台。系统优化了将两亲性TLR4激动剂单磷酸脂A（MPLA）纳入新开发平台的脂质双层中的过程。两种类型的颗粒——固体和介孔颗粒——都提供了稳定的表面结构，以增强膜稳定性。通过改变胆固醇（15–45%）和阴离子脂质（DPPG）（10–30%）的含量，我们确定了影响TLR4激活、膜流动性和颗粒-细胞相互作用的关键组成参数。当胆固醇含量增加到45%且DPPG含量为20%时，固体核心的MPLA-SiNPs显示出比未配制的MPLA更强的免疫刺激活性；而介孔的MPLA-MSNs则需要30%的DPPG含量才能达到类似的激活效果。为了进一步改进性能，应用了贝叶斯优化（BO）方法，显著提升了MPLA-SiNPs的性能。优化后的MPLA-SiNPs的EC50值为87 ng/mL，优于传统的配方策略。这一优化结果比使用传统单因素一次优化方法得到的EC50值低60 ng/mL，比未配制的MPLA低280 ng/mL。携带TLR4受体的巨噬细胞能够有效内化并处理这些颗粒。这些发现强调了合理配方设计的重要性，并展示了脂质包覆二氧化硅纳米颗粒作为模块化疫苗载体的潜力。这一多功能且模块化的平台未来可以用于递送其他TLR激动剂，并且还可以配备抗原。
引言
像Toll样受体（TLR）激动剂这样的佐剂能够刺激先天免疫系统，并在适应性免疫反应过程中对免疫原效果不佳的抗原产生额外的增强作用（Kaur等人，2022年；Pulendran等人，2021年）。为了在引流淋巴结中达到足够的浓度以激活免疫细胞，通常使用尺寸小于200纳米的纳米级载体来递送TLR激动剂（Oussoren等人，1997年；Swartz等人，2008年；Reddy等人，2007年；Manolova等人，2008年）。尽管存在许多纳米级的TLR激动剂配方（Gu等人，2024年；Hamid等人，2025年；Naz等人，2025年；LaBauve等人，2018年），但它们通常是为特定的TLR激动剂量身定制的。然而，选择不同的TLR激动剂需要开发新的配方。我们的目标是创建一个能够方便更换TLR激动剂，并在未来添加抗原的递送平台。
作为概念验证，我们决定为TLR4激动剂单磷酸脂A（MPLA）开发一种配方。MPLA被用于多种已获许可的预防性疫苗中，如Fendrix?（乙型肝炎病毒疫苗）（Hernán-García等人，2025年）、Cervarix?（人乳头瘤病毒-16和-18疫苗）（D'Onofrio等人，2025年）、RTS,S?（疟疾疫苗）（Friedman-Klabanoff等人，2025年）以及Pollinex? Quattro（草花粉过敏疫苗）（Zimmermann等人，2022年）。在已批准的疫苗中，MPLA被纳入佐剂系统，如基于脂质体的AS01、油包水乳液AS03或明矾吸附的AS04（Laupèze等人，2019年）。MPLA配方的开发具有挑战性，因为一方面需要高负载量和运输过程中的足够稳定性（Peletta等人，2023年），另一方面MPLA需要以单体形式存在才能激活受体（Du等人，2024年）。因此，一旦到达目标细胞，必须从配方中“提取”MPLA，并借助适配蛋白MD-2将其以单体形式呈现给细胞外的TLR4受体（Du等人，2024年；Botos等人，2011年；Ignacio等人，2018年）。这很具挑战性，因为MPLA是一种两亲性分子，其临界胶束浓度非常低（10^-9 mol/L）（Liu等人，2017年），因此在生理环境中通常以聚集态存在（Du等人，2024年）。
对于我们的递送平台，我们选择了二氧化硅纳米颗粒，因为它们满足淋巴节点运输的尺寸上限（约200纳米），具有生物相容性和可生物降解性，并且其表面易于修饰（Navarro-Tovar等人，2016年）。我们已经利用固体二氧化硅纳米颗粒（SiNPs）以明确和定向的方式固定HIV-1的包膜抗原和SARS-CoV-2的受体结合域（RBD）（Barbey等人，2023年；Thalhauser等人，2020年）。除了固体SiNPs，我们还选择了介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs），它们具有可调节的孔径结构，孔径范围从2到50纳米（Navarro-Tovar等人，2016年；Li等人，2018年）。这些孔径可以控制降解时间（Croissant等人，2017年），例如可以用于携带额外的活性分子。我们假设用脂质体膜包覆二氧化硅纳米颗粒可以创建一个模块化的递送平台，结合了二氧化硅纳米颗粒的结构稳定性和尺寸控制以及脂质体的组成多样性（Navarro-Tovar等人，2016年；B. V?r?s-Horváth, A. Salem, B. Kovács, A. Széchenyi, Systematic Study of Reaction Conditions for Size-Controlled Synthesis of Silica Nanoparticles, Nanomaterials (Basel, Switzerland) 14, 2024年；Nsairat等人，2022年）。二氧化硅核心的刚性结构确保了尺寸的一致性，并防止了聚集，这是脂质体在储存和运输过程中的常见问题（Mizuta等人，2023年；Patel等人，2020年）。根据使用的是固体SiNPs还是介孔MSNs，我们将脂质包覆的颗粒分别称为LC-SiNPs或LC-MSNs。
我们利用LC-SiNPs和LC-MSNs上的脂质膜来结合两亲性MPLA。一方面是为了在脂质双层中实现MPLA的稳定定位，另一方面是为了使其释放以在TLR4上发挥作用。我们的目标是使用两性离子二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC，一种卵磷脂）、阴离子二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）和胆固醇的不同比例来确定最佳的脂质体膜配方。对于某些配方，还使用了聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG）来提高胶体稳定性（LaBauve等人，2018年）。首先，通过改变胆固醇含量来影响膜的流动性（Subczynski等人，2017年；Kaddah等人，2018年）。其次，通过改变DPPG和MPLA的用量来改变颗粒的电荷密度。静电排斥不仅影响颗粒间的聚集，还影响与细胞的相互作用（Sanità等人，2020年）。采用传统的单因素一次优化方法只能观察到一个变量的效果，而各变量之间的相互作用尚不清楚（Gisperg等人，2025年）。因此，可能只能找到局部最优解而非全局最优解。贝叶斯优化（BO）可以克服这一障碍（Gisperg等人，2025年），它将机器学习与自适应采样结合到全局优化算法中。因此，我们使用BO对配方进行了最终优化，并在体外测试了它们对表达TLR4的报告细胞的生物效应，以评估佐剂的可用量。这里的“可用性”不仅指MPLA的浓度，还包括其从脂质膜中释放出来并激活TLR4的能力，即其以单体形式的存在。
材料
所有化学品均从Sigma-Aldrich（德国陶夫基兴）购买，除非另有说明。100纳米的固体SiNPs（sicastar? white和sicastar? greenF悬浮液）购自micromod Partikeltechnologie GmbH（德国罗斯托克）。氯化钠（p.a.）和胆固醇（≥95%）来自Carl Roth（德国卡尔斯鲁厄）。合成MPLA购自InvivoGen（法国图卢兹）。RPMI 1640培养基和L-谷氨酰胺来自Thermo Fisher Scientific（德国达姆施塔特）。
LC-SiNPs和LC-MSNs的制备与表征及MPLA的嵌入
固体SiNPs和介孔MSNs分别被脂质膜包覆，生成LC-SiNPs和LC-MSNs。制备脂质体时，使用了由中性DPPC、胆固醇和负电荷DPPG按45:35:20摩尔比组成的混合脂质。未包覆的SiNPs和MSNs的流体动力学直径分别为104（±1）纳米和130（±2）纳米（图1a）。MSNs具有中心径向排列的孔隙，孔径分布较窄，约为3.7纳米。
讨论
佐剂对于基于蛋白质的疫苗的成功至关重要，特别是对于免疫原性较低的抗原（Kaur等人，2022年；Pulendran等人，2021年；Ramezani-Rad等人，2025年）。TLR激动剂常被用作已获许可疫苗和研究中的佐剂（Kaur等人，2022年；Yang等人，2022年；Alving等人，2020年；Kayesh等人，2025年；Burton等人，2012年）。为了充分发挥TLR激动剂在适应性免疫反应中的作用，需要将其传递到
结论与展望
本研究采用系统化和多层次的方法优化了脂质包覆的二氧化硅纳米颗粒（LC-SiNPs和LC-MSNs），作为多功能的TLR激动剂载体，旨在提高疫苗应用的免疫刺激效果。这一模块化平台未来也可用于其他TLR激动剂。例如，其他两亲性TLR激动剂如Pam3CSK4（TLR1/2激动剂）（Zhou等人，2024年）可以类似MPLA的方式嵌入膜中，或者亲水性激动剂也可以
CRediT作者贡献声明
安德烈亚斯·G·施赖伯（Andreas G. Schreiber）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，方法学，研究，数据分析，概念化。约翰内斯·康拉德（Johannes Konrad）：方法学。雷娜特·利布尔（Renate Liebl）：方法学。巴斯蒂安·贝茨inger（Bastian Beitzinger）：方法学。扬·克鲁蒂纳（Jan Krutina）：方法学。格雷戈尔·马德杰（Gregor Madej）：方法学。米卡·林登（Mika Lindén）：撰写 – 审稿与编辑，监督。克里斯蒂娜·齐格勒（Christine Ziegler）：撰写 – 审稿与编辑，监督。米里亚姆·布罗尼格（Miriam Breunig）：撰写 – 审稿与编辑，监督，研究。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢Lipoid GmbH提供的磷脂捐赠。同时感谢Yana Gorbatii和Merve G?kalp提供的技术支持。
