《Journal of Biological Chemistry》：An evolutionarily conserved salt bridge stabilizes the active site for GTP hydrolysis in Rho GTPases
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本研究针对Rho GTPases活性位点稳定性机制不明确的问题，通过X射线晶体学、加速分子动力学模拟和酶学实验，发现Rho亚家族特有的R70-E102盐桥通过变构调控机制稳定GTP水解活性位点构象。该盐桥的破坏会导致开关区动态特性改变和催化活性显著降低，为理解Rho GTPases在肿瘤发生中的功能异常提供了新视角。
在细胞信号转导的复杂网络中，小GTP酶作为分子开关发挥着核心调控作用。其中Rho GTPases作为Ras超家族的重要成员，通过调节细胞骨架重组、细胞极性和运动等过程，在细胞形态维持和运动迁移中扮演关键角色。与著名的Ras亚家族类似，Rho GTPases的功能失调与多种肿瘤的发生发展密切相关，特别是在癌症侵袭和转移过程中起着重要作用。然而，与Ras蛋白不同，Rho GTPases在肿瘤中的致癌突变频率较低，其功能调控机制仍有许多未解之谜。
一个长期困扰研究人员的问题是：为什么Rho GTPases具有比Ras蛋白更高的本征GTP水解速率？这种差异是否源于两个亚家族在活性位点稳定机制上的根本不同？为了回答这些问题，来自美国东北大学化学与化学生物学系的Kendra Marcus、Michael Schwabe、Ryan Knihtila和Carla Mattos研究团队开展了一项深入研究。他们的研究成果发表在《Journal of Biological Chemistry》上，揭示了Rho GTPases中一个进化保守的结构特征——盐桥在稳定GTP水解活性位点中的关键作用。
研究人员主要运用了多项前沿技术方法：X射线晶体学解析了野生型和突变型RhoA及H-Ras的三维结构；加速分子动力学模拟(aMD)分析了蛋白质构象动态变化；酶动力学实验测定了GTP水解速率常数；进化序列分析评估了盐桥在不同物种中的保守性；分子对接和结构比对揭示了Rho与Ras亚家族的结构差异。
盐桥相互作用在Rho亚家族中高度保守并呈现共进化模式
研究团队通过结构比对发现，在Rho GTPases中存在一个高度保守的盐桥相互作用，由位于开关II的R70和螺旋3的E102形成。这一结构特征在近所有可用的Rho GTPase晶体结构中都被观察到，而在Ras蛋白中则不存在。序列分析显示，在198个Rho亚家族成员中，79%的蛋白在70位点含有精氨酸，84%在102位点含有谷氨酸，排除Miro型GTPases后，保守性分别达到97.5%和98.7%。
野生型RhoA GTPase与GppNHp结合显示开关II和螺旋3之间的螺旋间连通性
研究人员解析了野生型RhoA与GppNHp复合物的晶体结构，发现R70-E102盐桥是更大相互作用网络的核心。E102通过氢键与Y74的侧链羟基相连，而R70还与D67形成盐桥。附近的K98与E64相互作用，将网络延伸至活性位点。这一离子相互作用网络比Ras中的水介导网络更加稳定，有助于维持开关II的螺旋构象。
Rho盐桥突变体表现出开关区去稳定化和活性位点解构
通过解析R70A和E102A突变体的晶体结构，研究人员发现盐桥的破坏会导致活性位点构象发生显著改变。R70A突变体中，开关I采取更开放的构象，Q63翻转远离活性位点。E102A突变体的四个不对称单元分子均显示出不同的开关构象，其中Y34被拉离活性位点，T37通过其主链羰基与镁离子配位，类似于GDP结合状态。
H-Ras R68A对活性位点的损害比RhoA中的对应突变轻
与RhoA R70A不同，H-Ras R68A突变对活性位点的影响相对较小。虽然开关II的N端区域出现无序，但开关I仍保持状态2构象。催化残基Q61虽然无序，但整体结构扰动较RhoA突变体温和，这与GTP水解速率常数的下降程度相符。
Rho盐桥突变影响内在GTP水解
酶动力学实验表明，盐桥突变会显著降低RhoA的GTP水解能力。R70A突变体的水解速率常数比野生型降低了近10倍，而E102A突变体也显示出明显下降。相比之下，H-Ras R68A突变体的水解速率仅下降约50%，进一步证实盐桥在Rho GTPases中具有更关键的作用。
Rho盐桥移除影响全局动力学
加速分子动力学模拟显示，盐桥的破坏会导致蛋白质全局动态特性发生改变。野生型RhoA的模拟轨迹显示蛋白质主要采样催化活性构象，而突变体则表现出活性位点解构和构象异质性增加。特别是R70A突变体，其开关区灵活性显著增加，活性位点组织严重受损。
研究结论表明，Rho亚家族特有的R70-E102盐桥通过变构机制稳定GTP水解活性位点，这是Rho GTPases实现高效本征GTP水解的关键结构基础。与Ras蛋白依赖水分子介导的变构网络不同，Rho GTPases进化出了更稳定的离子相互作用网络，这可能与其在细胞运动、分裂等需要快速信号响应过程中的功能需求相关。该盐桥在肿瘤样本中频繁突变，其破坏会导致GTP水解受损和持续信号激活，与肿瘤发生发展密切相关。这一发现不仅深化了对Rho GTPases功能调控机制的理解，也为针对该家族蛋白的药物设计提供了新的靶点视角。
研究的重要意义在于首次系统揭示了Rho GTPases中盐桥网络在维持活性位点完整性和调控GTP水解中的核心作用，从进化角度阐释了Rho与Ras亚家族在功能实现机制上的分化，为理解这些关键信号蛋白在生理和病理过程中的作用机制提供了新的理论依据。
