《Journal of Biological Chemistry》：The SETD2 L1609P mutation found in leukemia disrupts methyltransferase activity and reduces histone H3K36 trimethylation
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本研究针对白血病中发现的SETD2 L1609P突变，通过酶学分析、细胞实验和晶体结构解析，首次揭示该突变通过破坏SET结构域β5链构象，导致H3K36三甲基化活性降低、蛋白稳定性下降及底物结合模式重塑，为SETD2失活驱动肿瘤发生提供了结构机制证据。
在肿瘤生物学领域，组蛋白修饰异常被视为癌症发生的重要推手。其中，组蛋白H3第36位赖氨酸的三甲基化（H3K36me3）作为基因转录调控、DNA损伤修复等关键生命活动的“开关”，其动态平衡对维持细胞正常功能至关重要。而催化这一修饰的核心“工匠”——SETD2蛋白，当其编码基因发生突变时，便可能引发一系列连锁反应，最终导致细胞癌变。尽管SETD2基因突变在多种癌症中频发，尤其聚集于其催化核心SET结构域，但绝大多数癌症相关突变如何影响SETD2酶的功能，其分子层面的精细变化至今仍是未解之谜。
为了揭开这一谜团，一项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究聚焦于在急性白血病患者中发现的一个特定SETD2错义突变——L1609P。研究人员综合运用生物化学、细胞生物学和结构生物学等多种技术手段，深入探究了此突变对SETD2酶功能的影响及其内在分子机制。研究发现，L1609P突变并非一个简单的氨基酸替换，它像一颗投入精密齿轮中的沙子，深刻扰动了SETD2的正常运转。该突变直接导致SETD2催化H3K36甲基化的能力严重受损，无论是针对组蛋白H3、核心组蛋白还是核小体底物，其生成H3K36me3的水平均显著降低。进一步探究发现，突变的SETD2蛋白自身也变得“脆弱”，其热稳定性和在细胞内的半衰期均明显下降，更容易被蛋白酶体降解，从而导致其在细胞中的丰度大幅降低。
为了从原子层面看清L1609P突变究竟如何“作祟”，研究人员成功解析了SETD2 L1609P突变体与H3K36M肽段及辅因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的三元复合物晶体结构，分辨率达到2.2埃。结构比对显示，虽然突变体整体折叠与野生型相似，但第1609位亮氨酸被脯氨酸取代后，由于其独特的环状结构和无法形成主链氢键的特性，直接“撑开”了原本规整的β5链，使其从β折叠片层转变为无序环区。这一局部构象的崩塌如同“多米诺骨牌”，引发了连锁效应：不仅相邻的β6链受到影响，更导致底物结合口袋的关键残基（如K1610）空间取向发生剧烈翻转，进而迫使底物肽段上的H3K37残基侧链为避免空间冲突而改变构象。最终，底物肽段C末端部分氨基酸在突变体结构中因结合不稳而“消失”，无法被观测到，表明其结合模式发生了根本性改变。分子动力学模拟也证实，L1609P突变导致整个SET结构域，尤其是底物结合相关区域的动态性和柔性增加，结构稳定性下降。
在细胞模型中，通过CRISPR/Cas9技术构建的表达SETD2 L1609P的HEK293T细胞，其内源性H3K36me3水平显著低于表达野生型SETD2的细胞，而SETD2 L1609P突变蛋白本身的表达量也更低。蛋白酶体抑制剂MG132处理能部分恢复突变蛋白的水平，证实其的确更易被降解。回补实验表明，只有在L1609P突变细胞中重新引入野生型SETD2，而非突变体自身，才能有效恢复H3K36me3水平。
本研究主要关键技术方法包括：蛋白质重组表达与纯化、体外甲基转移酶活性测定（使用荧光肽底物结合UFLC分析）、酶动力学分析、热位移分析（TSA）、细胞培养与CRISPR/Cas9基因编辑（构建等基因细胞系）、免疫荧光与蛋白质印迹（Western Blot）、X射线晶体学（解析突变体三元复合物结构）以及分子动力学（MD）模拟。研究中使用的核心组蛋白来源于HEK293T SETD2基因敲除（KO）细胞。
RESULTS AND DISCUSSION
The SETD2 L1609P mutant exhibit reduced lysine methyltransferase activity and protein stability in vitro
研究人员首先在体外证实了SETD2 L1609P突变体的功能缺陷。该突变位于SET结构域内一个高度保守的疏水口袋中，此区域对于识别底物H3K36至关重要。纯化的SETD2 L1609P催化核心在体外催化组蛋白H3、核心组蛋白或核小体发生H3K36三甲基化的能力均显著低于野生型。利用超快液相色谱（UFLC）分析其对不同甲基化状态底物（H3K36me0, H3K36me1, H3K36me2）的催化活性，发现突变体的单、双、三甲基化活性均降至野生型的15-20%。酶动力学分析表明，突变体的催化效率（kcat/Km）降低了约2.5倍，主要归因于其对底物亲和力的下降（Km值升高）。此外，突变体的自身甲基化（auto-methylation）及其对非组蛋白底物α-tubulin的甲基化能力也严重受损。热位移分析显示，L1609P突变体的热稳定性（熔解温度Tm）显著低于野生型，表明其内在结构稳定性降低。
The SETD2 L1609P mutation results in low cellular levels of the H3K36me3 mark and reduced SETD2 expression in CRISPR-edited HEK293T cells
在细胞水平上，通过CRISPR/Cas9技术在HEK293T细胞中构建了表达SETD2 L1609P的等基因细胞系。免疫荧光和蛋白质印迹分析均显示，与野生型细胞相比，SETD2 L1609P细胞中的内源性H3K36me3水平显著降低，而H3K36me1/2水平无显著变化。同时，SETD2 L1609P突变蛋白在细胞中的表达量也明显低于野生型。蛋白酶体抑制剂MG132处理可部分恢复突变蛋白的水平，提示其通过蛋白酶体途径被降解。在SETD2基因敲除细胞中进行回补实验，只有转染野生型SETD2才能有效恢复H3K36me3水平，而转染L1609P突变体则不能。放线菌酮（cycloheximide）追踪实验进一步证实突变体蛋白在细胞内的半衰期缩短。
Determination of the crystal structure of the SETD2 L1609P mutant in complex with a H3K36M peptide and S-adenosylmethionine (SAM) cofactor
晶体结构分析揭示了L1609P突变的结构基础。虽然突变体整体结构与野生型相似，但L1609P的替换导致其所在的β5链构象发生剧烈变化，从规则的β折叠转变为无序环区。这一变化破坏了由β4-β6-β5链组成的β片层结构，该片层是SET结构域特征性三角结构的一部分，对底物结合至关重要。构象变化进一步波及相邻残基（如K1610），导致其侧链发生约140度翻转，朝向底物肽段的H3K37，从而引发空间冲突，迫使H3K37侧链调整构象以避免碰撞。最终，底物结合口袋被重塑，H3K36M肽段C末端残基（R40-R42）在突变体结构中因结合不稳而无法被观测到。相互作用分析表明，突变体失去了一些野生型中存在的SETD2与H3肽段之间的相互作用（如M1607-P38, K1639-P38），但同时产生了一些新的相互作用（如K1610-P38/H39）。分子动力学模拟证实，突变体整体结构波动性更大，灵活性增加，稳定性降低。
结论与意义
本研究通过多维度实验体系，首次系统阐明了白血病相关SETD2 L1609P突变导致功能失活的分子机制。突变不仅直接削弱了酶的甲基转移酶活性，更通过破坏SET结构域关键β片层的稳定性，引发局部构象崩塌和底物结合模式异常，同时降低了蛋白本身的稳定性，加速其降解。这为理解SETD2作为肿瘤抑制因子在白血病等癌症中的作用提供了坚实的生化与结构基础，强调了SET结构域内特定残基对维持酶活性和结构完整性的关键作用。该研究不仅增进了对表观遗传调控异常在肿瘤发生中作用机制的认识，也为未来针对SETD2功能异常相关疾病的干预策略提供了新的思路和靶点。
