《Journal of Biological Chemistry》：Alix Mediated Selective Packaging of β-Catenin into Extracellular Vesicles Enhances Their Pro-Angiogenic Function
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本研究针对细胞外囊泡（EVs）功能调控机制不明确的问题，聚焦Alix蛋白在β-catenin选择性装载过程中的关键作用。研究人员通过构建Alix敲低/过表达间充质干细胞模型，发现Alix通过直接结合β-catenin促进其富集于EVs，进而激活Wnt/β-catenin信号通路增强血管生成。该研究为缺血性疾病治疗提供了新的靶向调控策略。
在再生医学领域，间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）因其多向分化潜能和旁分泌功能备受关注。近年来，MSCs分泌的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为天然治疗剂展现出巨大潜力。这些纳米级囊泡能够携带蛋白质、核酸等生物活性分子，在细胞间通讯中扮演重要角色。然而，EVs的功能高度依赖于其携带的分子货物，如何精准调控EVs的货物装载以提高其治疗效果，仍是当前研究的难点。
南开大学医学院李瑞、潘凯等研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表的研究，首次揭示了Alix蛋白通过选择性包装β-catenin进入EVs增强其促血管生成功能的新机制。研究人员发现，作为ESCRT（内体分选复合体）辅助蛋白的Alix，能够与Wnt信号通路关键分子β-catenin直接相互作用，从而调控β-catenin在EVs中的富集程度。这一发现不仅阐明了EVs货物分选的分子机制，更为开发高效促血管生成疗法提供了新思路。
关键技术方法包括：通过病毒转导构建Alix敲低（KD）和过表达（OE）的人胎盘源MSCs（hP-MSCs）模型；采用超速离心法分离EVs并利用动态光散射、透射电镜进行表征；通过免疫共沉淀、免疫荧光验证蛋白相互作用；运用小鼠后肢缺血模型评估EVs的促血管生成功能；采用伤口愈合、血管形成实验等体外功能分析。
表征Alix敲低hP-MSC来源的EVs
研究人员首先通过免疫荧光染色证实了Alix与β-catenin在hP-MSCs中的共定位。成功构建Alix-KD和Alix-OE的hP-MSCs后，Western blot分析显示Alix敲低显著降低了EVs中β-catenin的含量，而过表达则增加其富集。EVs表征实验证实，Alix调控不影响EVs的分泌数量，但会改变其货物组成。
Alix敲低EVs减弱体外血管生成能力
功能实验表明，与对照组相比，Alix-KD-EVs处理的HUVECs迁移能力和血管形成能力显著降低，血管生成相关基因（ANG-1、VEGFA、VEGFR2）表达下降。相反，Alix-OE-EVs表现出更强的促血管生成作用。
Alix过表达EVs增强体内血管生成
在小鼠后肢缺血模型中，Alix-OE-EVs治疗组显示出更强的VEGFR2荧光素酶信号和CD31阳性微血管密度，组织学分析也表明其能有效减轻组织损伤和纤维化。
Alix介导与β-catenin的相互作用
通过Co-IP和免疫荧光实验，研究证实Alix与β-catenin存在直接相互作用，且该作用不依赖于ESCRT复合体成分CHMP4B。这表明Alix直接参与β-catenin向EVs的分选过程。
Alix敲低EVs通过抑制Wnt/β-catenin信号通路减弱血管生成
机制研究表明，Alix-KD-EVs处理的HUVECs中β-catenin核转位减少，Wnt通路下游基因（cyclin D1、c-Myc）表达降低，而AKT和ERK信号通路未发生显著变化，证实Alix调控的EVs主要通过Wnt/β-catenin通路发挥功能。
本研究系统阐明了Alix通过直接相互作用促进β-catenin选择性包装进入EVs的分子机制。这种调控方式显著影响EVs的促血管生成功能：Alix过表达使EVs富含β-catenin，激活受体细胞Wnt信号通路，增强血管生成相关基因表达；而Alix敲低则产生相反效果。该发现不仅深化了对EVs生物发生机制的理解，更重要的是为开发靶向调控EVs功能的治疗策略提供了新途径。通过精确调控MSCs中Alix表达水平，可获得具有增强治疗潜力的EVs，为缺血性疾病、组织修复等提供更有效的治疗方案。
