《Journal of Biological Chemistry》：A brain-gut excitatory peptide/CCHamide homolog regulates satiation and motivational state transitions in the
Aplysia feeding circuit
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本期推荐一篇发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究。为探究软体动物中脑-肠肽EP/CCHa的摄食调控功能，研究团队在模式生物Aplysia中鉴定了其前体、受体及分布，发现该肽可抑制摄食并将摄食运动程序转为排出程序，其通过调节关键中枢模式发生器中间神经元兴奋性实现功能，首次在软体动物中阐明EP/CCHa作为饱腹信号的神经环路机制。
你是否想过，一个小小的海蛞蝓（Aplysia），它的“大脑”和“肠胃”之间，竟然存在着一种古老的“对话”信号，能告诉它“吃饱了，该停了”？这种信号就是神经肽。在高等动物中，诸如胃泌素释放肽GRP等“脑-肠肽”是著名的饱腹信号。而在无脊椎动物原口动物中，有一类名为兴奋肽EP/CCHamide的神经肽，它们结构相似，在环节动物和节肢动物中均有发现，且在脑和肠道中都有表达，提示它们可能也扮演着类似的“信使”角色。然而，这些肽类具体如何调控摄食行为，其作用的神经环路机制是什么，在软体动物中是否发挥功能，一直是个未解之谜。为了回答这些问题，一支研究团队利用拥有明确且易于研究的摄食神经环路的经典模型生物Aplysia，开展了一项深入而全面的研究。
他们的研究揭示，在Aplysia中存在一种单一的EP/CCHa同源肽，它确实是一种脑-肠肽，能够显著抑制动物的食物摄入，并在离体实验中促使摄食性运动程序向排食性程序转换。更为重要的是，他们首次在软体动物中鉴定并功能验证了两个EP/CCHa受体，并发现这些受体表达在摄食中枢模式发生器的关键中间神经元上。通过调节这些神经元的兴奋性，EP/CCHa实现了对摄食动机状态的精准调控。这项研究不仅首次在软体动物中明确了EP/CCHa的饱腹信号功能，还从分子、细胞到环路层面阐明了其作用机制，为理解脑-肠轴在摄食控制中的古老进化起源提供了关键证据。相关成果发表在《Journal of Biological Chemistry》上。
为开展此项研究，作者综合运用了多种关键技术方法。在分子鉴定方面，利用生物信息学BLAST搜索和PCR克隆确定了Aplysia EP/CCHa前体及两个受体的基因序列。通过液相色谱-串联质谱对中枢神经节提取物进行分析，验证了成熟肽的存在及二硫键等翻译后修饰。在表达谱分析中，采用了原位杂交和免疫组织化学技术，系统描绘了该肽及其受体mRNA在中央神经系统和各外周组织（特别是消化道）中的分布图谱。在功能验证层面，通过在体注射实验评估了肽对动物摄食行为的影响；利用离体电生理记录，结合CBI-2中间神经元电刺激诱发的运动程序，分析了该肽对摄食网络活动模式的调控作用。此外，研究还借助已发表的单细胞RNA测序数据，确定了两个受体在特定摄食中枢模式发生器中间神经元中的表达。最后，通过细胞水平（CHO-K1细胞）的IP1积累实验，功能验证了克隆受体的活化及其对配体的剂量反应关系。
研究结果
Aplysia中EP/CCHa前体的鉴定
研究人员通过生物信息学分析和PCR克隆，在Aplysia中鉴定了一个编码EP/CCHa样肽的前体基因。该前体预测产生一个15个氨基酸的成熟肽，序列为KCHGRWAIHACFGGN-NH2，具有形成分子内二硫键的两个半胱氨酸和C末端酰胺化修饰，这些特征与其他原口动物的EP/CCHa肽保守。
apEP/CCHa前体mRNA及肽在中枢神经系统的分布
原位杂交和免疫组织化学实验显示，apEP/CCHa的mRNA和肽阳性神经元广泛分布于包括摄食相关的重要神经节——脑神经节和颊神经节在内的所有中枢神经节中。免疫阳性纤维在支配肠道的食管神经中富集，提示其可能参与脑-肠通讯。
质谱鉴定Aplysia中的成熟apEP/CCHa
通过对中枢神经节提取物进行还原/烷基化处理以打开二硫键，并结合液相色谱-串联质谱分析，直接检测到了线性化的成熟apEP/CCHa肽，证实了该活性肽在中枢神经系统的存在。
apEP/CCHa的外周来源
免疫组织化学实验在食管前部的背侧纵褶附近以及位于嗉囊和砂囊之间的胃环中，发现了apEP/CCHa免疫阳性细胞。这些位于消化道的外周细胞进一步证实了apEP/CCHa作为一种脑-肠肽的特性。
apEP/CCHa受体的鉴定
通过BLAST搜索和PCR克隆，鉴定出两个推定的G蛋白偶联受体，分别命名为apEP/CCHaR1和apEP/CCHaR2。系统发育分析表明，apEP/CCHaR1与其它冠轮动物EP/CCHa受体聚为一类，而apEP/CCHaR2则意外地与节肢动物CCHa受体聚为一类，提示这两个受体可能属于不同的进化谱系。在CHO-K1细胞中进行的IP1积累实验证实，两者均可被apEP/CCHa激活，EC50值分别为30 nM和28 nM。
apEP/CCHa在体抑制食物摄入
向完整动物体内注射apEP/CCHa，在1.5 x 10-8M浓度下可显著减少食物摄取量，且不引起明显的非特异性行为异常，表明其具有作为饱腹信号抑制摄食的行为学功能。
apEP/CCHa在离体条件下调控摄食程序
在离体神经节制备中，通过电刺激摄食命令神经元CBI-2诱发的摄食性运动程序，在apEP/CCHa作用下，程序特征发生改变：摄取相时长缩短，同时负责食物闭合的运动神经元B8的活动时相从以回缩相为主转变为以前伸相为主，这意味着程序从摄食性转变为排食性。
apEP/CCHa对中枢模式发生器中间神经元兴奋性的影响
单细胞RNA测序数据显示，两个apEP/CCHa受体均在关键的摄食中枢模式发生器中间神经元B20和B34中表达。电生理记录表明，apEP/CCHa以浓度依赖的方式降低促进长前伸相的B34神经元和促进摄食程序的B40神经元的兴奋性，同时增强促进排食程序和短前伸相的B20神经元的兴奋性，并对终止前伸相的B64神经元的兴奋性有短暂增强作用。这些对特定中间神经元兴奋性的差异性调制，共同解释了该肽在环路水平上将摄食程序转换为排食程序并缩短前伸相的效应。
研究结论与意义
本研究首次在软体动物Aplysia中对EP/CCHa神经肽信号系统进行了全面的功能鉴定。结果表明，apEP/CCHa是一种在脑和肠道均有表达的脑-肠肽，它通过抑制食物摄入和促进摄食程序向排食程序转换，发挥着饱腹信号的功能。研究人员成功克隆并鉴定了两个功能性的apEP/CCHa受体，发现它们分别属于不同的进化支系。更为关键的是，研究将受体的作用定位到了摄食中枢模式发生器的特定中间神经元（B20和B34等），并通过电生理记录揭示了apEP/CCHa通过差异性地调制这些关键节点的兴奋性，从而实现对摄食动机状态转换的精细调控。
这项工作的意义重大。首先，它填补了软体动物中EP/CCHa信号系统功能研究的空白，为这类肽在原口动物中的保守功能提供了直接证据。其次，研究从分子、细胞到神经网络层面，清晰地阐明了一个脑-肠肽调控固有行为节律的完整机制，展示了利用简单模型系统进行环路水平机制解析的独特优势。最后，该研究强化了EP/CCHa信号系统与后口动物的内皮素及蛙皮素型肽信号系统之间的进化同源性，尽管apEP/CCHa在功能上更类似于后者的饱腹作用，但其受体在系统发育上却与内皮素受体关系更近，这揭示了神经肽-受体协同进化中的复杂性。总之，该研究不仅深化了对摄食控制基本机制的理解，也为探讨脑-肠轴调控行为的进化起源提供了重要视角。
