《Journal of Chromatography A》：Retention peculiarities of furocoumarins on pentahalogenphenyl stationary phases in supercritical fluid chromatography
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胡萝卜素分离中，超临界流体色谱（SFC）基于五氟苯基固定相展现出对角型与线型胡萝卜素及取代基位置的特异性洗脱顺序。研究以巨大罂粟为原料，通过SFE提取胡卜素混合物，半制备SFC分离结合NMR和质谱鉴定，发现角型胡卜素先洗脱，线型中8位单取代优先，其次5,8位双取代，最后5位单取代。机理涉及平面接触（π堆积）与取代基空间位阻差异，8位取代物因构象可变阻碍固定相接触。
Oleg Pokrovskiy | Denis Ovchinnikov | Irina Rostovschikova | Anna Faleva | Dmitry Kosyakov
俄罗斯科学院库尔纳科夫普通与无机化学研究所，莫斯科，俄罗斯
摘要
呋喃香豆素是一类由多种植物产生的天然化合物，广泛应用于药理学领域。由于它们在自然界中的多样性以及结构上的相似性，其分离和纯化过程颇具挑战性。先前研究表明，使用五氟苯（PFP）作为固定相的超临界流体色谱法（SFC）在分离从天然来源提取的呋喃香豆素混合物方面具有出色的选择性。本文报道了从Heracleum sosnowskyi（巨型猪殃殃）中分离出角状和线性呋喃香豆素的实例。首先通过超临界流体萃取法从巨型猪殃殃的根中提取富含呋喃香豆素的提取物，随后利用半制备型SFC技术分离出单个呋喃香豆素，并通过核磁共振光谱（NMR）和质谱（MS）技术对其进行了鉴定。在SFC过程中观察到呋喃香豆素的洗脱顺序存在独特性：无论取代基的大小如何，角状呋喃香豆素总是先于线性呋喃香豆素洗脱；而在线性呋喃香豆素中，8-位单取代的呋喃香豆素先于5,8-位双取代的呋喃香豆素洗脱，最后才是5-位单取代的呋喃香豆素。对于这种异常洗脱顺序的可能解释基于两个观点：1) 呋喃香豆素在PFP固定相上的保留受到其与PFP分子之间特定相互作用的影响，这种相互作用可能需要两者之间的平面接触，可能涉及π堆叠；2) 由于呋喃香豆素的芳香结构，5位上的取代基在空间上固定在同一平面上，而8位上的取代基则具有较高的构象灵活性，能够自由旋转，这种旋转阻碍了呋喃香豆素与PFP环之间的平面接触，从而降低了保留作用。
引言
呋喃香豆素（FCs）主要由伞形科、芸香科、桑科和豆科植物产生，这些化合物能够保护植物免受昆虫和微生物的侵害[1]。呋喃香豆素具有多种生物活性，被用于传统和现代医学中，作为抗增殖、抗菌、抗病毒、光敏化以及抗凝血等药物成分[2,3]。从植物中分离呋喃香豆素是一项具有挑战性的任务，因为植物材料中的呋喃香豆素种类繁多且化学性质相近。吸附相色谱法（normal-phase chromatography）在分离呋喃香豆素方面具有优势，因为吸附剂-溶质之间的相互作用多样，可以针对结构相似的化合物实现所需的分离选择性。与液相色谱（LC）相比，超临界流体色谱法（SFC）由于具有更快的平衡时间、流动相中不含水以及丰富的固定相选择范围，成为分离天然产物中中性化合物的有效方法[4, [5], [6]]。较低的粘度和较高的扩散性使得分离速度更快，平衡时间更短，特别适用于制备型分离。压力释放后二氧化碳的自动蒸发简化了产物的回收和流动相的再生过程。流动相中不含水和无机盐，进一步有利于获得纯净的分离组分。对于光敏性的呋喃香豆素而言，分离组分的纯化和干燥过程更加便捷，因为这样可以减少光降解。此外，相同的SFC流动相组合可与多种固定相配合使用，实现从常规分离到离子对分离等多种分离模式[4], [5], [6], [7]]。这一特性使得SFC方法的发展更加复杂，但同时也为其提供了更广泛的选择性调控手段。
2009年，Lesellier和West测试了一系列固定相（SP），用于从柑橘油中分析分离各种取代的线性呋喃香豆素，发现某些含有五氟苯（PFP）官能团的固定相对呋喃香豆素具有异常高的选择性[8]。他们观察到5-位和8-位取代的线性呋喃香豆素的保留行为存在一些有趣的特点：所有8-位取代的呋喃香豆素首先洗脱，接着是5,8-位双取代的呋喃香豆素，最后才是5-位单取代的呋喃香豆素。后续研究团队在更广泛的呋喃香豆素亚类中验证了这些发现，证明PFP固定相能够实现优异的分离效果[9], [10], [11], [12], [13], [14]]。
从机制角度来看，呋喃香豆素在PFP固定相上的行为较为特殊。传统上用于SFC的其他固定相（无论是极性的还是非极性的）都无法提供类似的选择性。这些分离过程中观察到的洗脱顺序令人困惑，因为没有观察到常规色谱法中常见的结构-保留相关性。这类不寻常的现象可能揭示了保留机制的更多信息，值得进一步研究。最近有研究探讨了SFC中卤代固定相上的保留机制[15], [16], [17], [18]]。West等人[15]使用扩展的Abraham描述符集（LFER方法）评估了离子相互作用对SFC中芳香固定相保留的影响，发现分析物极性（s因子）和正离子化能力（d+因子）对保留有显著贡献，而极化率（v因子）和色散作用（v因子）的贡献相对较小。正离子化能力的贡献归因于氟原子与可质子化化合物之间的极性定向相互作用。另一组研究使用更广泛的LFER描述符集分析了包括五溴苯（PBr）在内的多种固定相[17]，发现PBr在SFC中的球形因子（g）显著为负，v因子和e因子较高，但d+因子却较低，与PFP相反[15]。Hirose等人[16]比较了同一制造商生产的不同功能团固定相在SFC和常规相色谱（NPLC，使用己烷代替二氧化碳）中的保留行为，发现PBr固定相对芳香化合物的保留能力更强，选择性也更高。Plachká等人[18]研究了带电表面混合氟苯（CSH FP）固定相的保留行为，发现极性和离子相互作用在该固定相中起重要作用，但尚不确定是PFP官能团还是连接基团在CO2-ROH介质中的质子化形式起主导作用。
在本文中，我们展示了一种从天然来源分离结构相近呋喃香豆素的新方法，并结合洗脱曲线和文献数据提出了一个详细的假设，以解释呋喃香豆素在PFP固定相上的保留行为。研究使用了Heracleum sosnowskyi（Manden）的根作为呋喃香豆素的来源。该植物含有大量甲基取代的角状和线性呋喃香豆素衍生物，这些衍生物在分子量、分子间相互作用和整体化学结构上较为接近，因此适合研究复杂的保留机制。此外，甲基取代的呋喃香豆素在药理学上研究较多，具有潜在的制备应用价值。呋喃香豆素的药理活性差异显著，例如5-甲氧基补骨脂素在银屑病光疗中效果更佳且副作用较少[19,20]，而相关的二取代化合物5,8-二甲氧基补骨脂素在光疗中无效[21,22]，但在其他医疗应用中有一定潜力[23]。因此，在呋喃香豆素的制备分离中确保高选择性尤为重要。由于大多数呋喃香豆素具有光敏性，它们容易发生光降解和光化学转化，这给分离方法带来了额外挑战。
材料
H. sosnowskyi（Manden）的根分别于2023年8月、2024年5月和2024年6月在俄罗斯莫斯科地区的Volokolamsk地区采集。采集后，材料用冷水彻底冲洗，切成约1-2厘米的小块，并在阴凉处风干两周。干燥后将其储存在-18°C的冰箱中。提取前直接对材料进行研磨。
用于提取的食品级二氧化碳（纯度99.8%）购自PGS-Service（Gorky）。
Heracleum sosnowskyi 呋喃香豆素的制备分离
Heracleum sosnowskyi是一种曾作为饲料种植的巨型猪殃殃，现在在俄罗斯及东欧部分地区成为入侵性杂草。选择它作为模型材料是因为其易于获取，并且由于其强烈的接触毒性，被认为含有高浓度的呋喃香豆素。由于该植物中含有丰富的呋喃香豆素，超临界流体萃取（SFE）成为分离呋喃香豆素的首选方法。
结论
研究表明，使用含有卤代芳香官能团的固定相进行SFC分离是一种出色的技术，无论是分析还是半制备规模，都能有效分离天然呋喃香豆素混合物，尤其是像Heracleum sosnowskyi根提取物这样的复杂混合物。如果做出某些假设，可以合理解释观察到的特殊洗脱顺序和亚组选择性现象。
作者贡献声明
Oleg Pokrovskiy：负责撰写初稿、方法学设计及概念构建。
Denis Ovchinnikov：负责审稿与编辑、方法学研究、数据管理。
Irina Rostovschikova：负责审稿与编辑、资源获取、数据分析及形式分析。
Anna Faleva：负责数据分析、形式分析及数据管理。
Dmitry Kosyakov：负责审稿与编辑、项目监督、方法学研究及资金申请。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了俄罗斯联邦科学与高等教育部的大力支持，属于俄罗斯科学院库尔纳科夫普通与无机化学研究所的国家科研项目。呋喃香豆素的分离与纯化以及NMR分析工作使用了罗蒙诺索夫北方（北极）联邦大学“Arktika”核心设施中心的仪器设备。
