《Advanced Science》：Xanthatin Targets CISD1 to Drive Ferroptosis and Mitophagy as a Dual Anticancer Strategy in Triple-Negative Breast Cancer
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本研究首次揭示天然化合物xanthatin通过直接结合线粒体蛋白CISD1的Trp-75位点，诱导其泛素化降解，进而破坏线粒体铁稳态并激活铁死亡（ferroptosis）与PINK1/Parkin介导的线粒体自噬（mitophagy），在三阴性乳腺癌（TNBC）中展现双重抗癌机制。该研究为TNBC提供了新型靶向治疗策略，凸显天然产物在攻克难治性肿瘤中的潜力。
1 引言
三阴性乳腺癌（TNBC）作为乳腺癌中最具侵袭性的亚型，因缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）表达，治疗手段有限且预后极差。尽管免疫检查点抑制剂和抗体-药物偶联物为部分患者带来希望，但其疗效仍局限于特定生物标志物人群。因此，开发高效低毒的新型小分子疗法成为当务之急。天然产物因其结构多样性和生物活性，一直是抗癌药物的重要来源。Xanthatin作为一种从苍耳属植物中分离的倍半萜内酯，此前研究报道其在胶质瘤、视网膜母细胞瘤和非小细胞肺癌中可通过内质网应激、ROS积累及NF-κB信号抑制发挥抗癌作用，但其在TNBC中的具体分子机制尚未明确。
线粒体外膜蛋白CDGSH铁硫结构域1（CISD1，亦称mitoNEET）作为[2Fe-2S]簇结合蛋白，在维持线粒体氧化还原稳态和铁硫簇转移中起关键作用。临床数据显示CISD1在乳腺癌、肺腺癌等多种恶性肿瘤中高表达，且与不良预后相关。功能上，CISD1过表达可增强肿瘤细胞增殖并缓解氧化应激，而其缺失则诱发线粒体功能障碍。本研究通过整合药理学与分子生物学手段，系统阐明xanthatin在TNBC中的抗癌机制，发现CISD1是其直接作用靶点，并揭示xanthatin通过Trp-75位点结合触发铁死亡与线粒体自噬的协同抗肿瘤效应。
2 结果
2.1 Xanthatin特异性抑制TNBC细胞增殖
通过500种天然产物库的高通量筛选，xanthatin在10 μM浓度下对TNBC细胞（MDA-MB-231和MDA-MB-468）表现出强效生长抑制活性，而对正常乳腺上皮细胞（MCF10A）毒性较低。剂量依赖性实验显示xanthatin对TNBC细胞的IC50值为2.45–5.63 μM，而对MCF10A的IC50高达53.9 μM，表明其显著的选择性。EdU掺入实验和克隆形成实验进一步证实xanthatin可有效抑制DNA合成和长期增殖能力。活/死细胞染色显示随xanthatin浓度增加，PI阳性死细胞比例显著上升。
2.2 Xanthatin诱导TNBC细胞铁死亡
转录组测序及KEGG富集分析表明，铁死亡通路在xanthatin处理后显著激活。实验验证显示xanthatin剂量依赖性增加细胞内ROS和脂质过氧化产物（4-HNE、MDA），同时耗竭谷胱甘肽（GSH）。Western blot检测到铁死亡关键抑制因子SLC7A11和GPX4表达下调，而铁摄取蛋白TfR1上调、铁储存蛋白FTH1下调。Fe2+荧光探针显示细胞内游离铁浓度升高，线粒体膜电位检测（JC-1染色）和电镜观察均提示线粒体损伤。此外，铁死亡抑制剂（Fer-1、DFO、NAC）可逆转xanthatin的细胞毒性，确认铁死亡为其主要死亡机制。
2.3 CISD1是Xanthatin的直接结合靶点
通过药物亲和响应靶点稳定性联合质谱（DARTS-MS）技术筛选出86个候选靶蛋白，其中CISD1因与铁死亡通路相关且结合潜能突出被选为后续研究对象。CETSA和表面等离子共振（SPR）实验证实xanthatin直接结合CISD1，解离常数（KD）为8.65 × 10?8。分子对接和分子动力学（MD）模拟揭示Trp-75是xanthatin与CISD1结合的关键残基。突变实验（CISD1W75A）及细胞救援实验表明，Trp-75突变可显著削弱xanthatin诱导的细胞死亡和铁积累，证实该位点在药效中的必要性。
2.4 Xanthatin通过CISD1激活线粒体自噬
mRFP-GFP-LC3报告系统显示xanthatin处理增加自噬流（黄/红斑点）。Western blot检测到LC3-II、PINK1和Parkin表达上调，而线粒体膜蛋白TOM20和p62下调。免疫荧光共定位显示LC3与线粒体（Mito-Tracker）及溶酶体标志物LAMP1共定位增强。Mito-Keima探针和电镜观察进一步证实xanthatin诱发线粒体向酸性区室转运及自噬体形成。氯喹（CQ）和3-MA抑制实验表明xanthatin促进自噬起始而非阻断降解。
2.5 铁死亡应激激活线粒体自噬
铁螯合剂DFO预处理可抑制xanthatin诱导的LC3-线粒体共定位和Parkin积累，而自噬抑制剂3-MA加剧xanthatin引起的ROS、Fe2+和4-HNE水平升高，说明铁死亡主导应激响应，线粒体自噬为其下游适应性反应。在BT-549细胞中验证了xanthatin跨TNBC细胞系诱导铁死亡和线粒体自噬的普适性。
2.6 CISD1在TNBC中高表达且促进肿瘤进展
生物信息学分析（TCGA、bc-GenExMiner）显示CISD1在TNBC组织和细胞中显著高表达，且与患者不良预后相关。组织芯片免疫组化证实71%的TNBC样本呈CISD1高表达（癌旁组织仅30%）。功能上，CISD1过表达增强细胞增殖和克隆形成，而shRNA敲低则抑制这些表型。
2.7 Xanthatin的抗癌效应依赖CISD1
在CISD1敲低细胞中，xanthatin对增殖的抑制能力显著减弱，且铁死亡标志物（ROS、Fe2+、MDA、GSH）和自噬指标（LC3-II）变化均被取消，证实CISD1是xanthatin引发双路径细胞死亡的核心介质。
2.8 Xanthatin通过Parkin介导的泛素化降解CISD1
Xanthatin处理不改变CISD1 mRNA水平，但通过泛素-蛋白酶体途径加速其蛋白降解。Co-IP实验显示xanthatin增强Parkin与CISD1的结合，促进CISD1泛素化。在Parkin敲低细胞中，xanthatin无法诱导CISD1降解，表明该过程依赖Parkin的E3连接酶活性。
2.9 Xanthatin在体内有效抑制TNBC生长且无系统毒性
在4T1原位TNBC小鼠模型中，xanthatin（10/20 mg/kg）剂量依赖性抑制肿瘤体积和重量。免疫组化显示肿瘤组织内CISD1和Ki-67下调，而铁死亡（GPX4↓、4-HNE↑、TfR1↑）和自噬（LC3↑）标志物改变，验证体内机制。血清生化（ALT/AST）和器官病理学未发现明显毒性，表明其良好安全性。
3 讨论
本研究系统阐释了xanthatin通过靶向CISD1-Trp-75触发铁死亡与线粒体自噬的双路径抗TNBC机制。CISD1作为线粒体铁稳态枢纽，其降解导致铁超载、脂质过氧化和线粒体损伤，而PINK1/Parkin通路的激活进一步放大细胞死亡信号。该研究不仅揭示CISD1作为TNBC治疗新靶点的潜力，还为天然产物开发提供创新视角。未来需深入评估xanthatin的药代动力学及联合用药策略，推动其临床转化。
4 材料与方法
实验涉及细胞培养、高通量筛选、分子互作验证（CETSA、SPR、MD模拟）、体内荷瘤模型等标准方法，详细流程见原文。
5 总结
Xanthatin作为首个直接靶向CISD1天然化合物，通过双重机制克服TNBC治疗困境，为代谢脆弱性靶向治疗奠定理论基础。
