《Advanced Science》：Microfluidic-Driven Lipid Nanoparticles for Improved miRNA Delivery via Endo-Lysosomal Trafficking Optimization
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本文系统研究了微流控制备的脂质纳米颗粒（LNP）在不同后处理（如超声、过滤、透析、热处理）下理化性质（粒径、PDI、Zeta电位、电泳迁移率、电导率）的变化及其对miRNA（microRNA）体外递送效率的影响。研究发现，后处理可显著调控LNP的稳定性和细胞内吞 trafficking，其中非透析样品虽具更优电动力学特性，但透析处理却能促进miRNA更早的细胞内可用性和持久性，为优化非病毒基因递送系统提供了新视角。
脂质纳米颗粒（LNP）的微流控制备与优化
本研究采用T型结微流控通道（宽度40 μm，高度50 μm）合成脂质纳米颗粒（LNP）。通过优化水相与油相流速比（600:200 μL/min），成功制备出平均粒径约155 nm、分布均匀的LNP。脂质组成确定为DODAP/DSPC/胆固醇/DSPE-PEG（10:49:40:1 mol/mol），在酸性缓冲液（25 mM醋酸钠，pH 4.0）中通过静电作用高效包载Cy3标记的miRNA，形成LNP-miRNA复合物。
LNP的形貌与粒径特征
扫描透射电镜（STEM）显示LNP和LNP-miRNA均呈球形、表面光滑。动态光散射（DLS）分析表明，miRNA的包载使LNP粒径从282.6 ± 5.1 nm显著增加至405.7 ± 5.0 nm（增幅43.6%），证实miRNA成功嵌入并引起结构重组。稀释至25%浓度后，LNP和LNP-miRNA的粒径分别降至174.3 ± 0.8 nm和216.1 ± 3.5 nm，显示浓度依赖性聚集效应。
后处理对LNP理化性质的调控
后处理步骤包括过滤（0.2 μm滤膜除菌）、超声（冰浴脉冲处理）、透析（两步法去除乙醇及缓冲液交换）和热处理（36°C孵育24 h）。超声和过滤协同降低粒径（LNP-miRNA从405.7 nm降至229.1 nm）并改善均匀性（PDI从0.6降至0.2）。透析虽进一步减小粒径（LNP-miRNA降幅达48%），但显著降低电泳迁移率（从3.16 μm·cm/V·s降至近零）和Zeta电位（从+34.8 mV降至+9.3 mV），同时使电导率从0.003 mS/cm升至15.6 mS/cm，提示离子强度增加可能影响稳定性。
LNP-miRNA的结合效率与完整性
基于Cy3-miRNA荧光检测，结合效率在甲醇和水溶液中分别为56.4% ± 8.8%和47.6% ± 9.3%，低于文献报道的>80%。研究表明该差异可能与微流控通道中miRNA的吸附损失有关，而PDMS材质（疏水性）较玻璃材质（亲水性）更具重现性。超声、热处理及联合处理未引起Cy3信号显著变化，表明miRNA在LNP内结构稳定。
体外生物相容性与细胞摄取
L929成纤维细胞实验显示，LNP、LNP-miRNA及透析后样品（LNP-miRNA_dial）均无显著细胞毒性，活细胞比例超99%。透析有效去除游离miRNA，改善细胞增殖（LNP-miRNA_dial组细胞数量高于非透析组）。共聚焦显微镜时序成像揭示：游离miRNA在30分钟内快速入胞，但信号在4小时后衰减；LNP-miRNA的Cy3信号延迟至2小时出现，胞质内分布持续至24小时；而LNP-miRNA_dial组在1小时即检测到信号，且呈现更早的胞内可用性。
内体-溶酶体运输与胞内命运
LysoTracker染色追踪显示，游离miRNA早期与酸性区室部分共定位，4小时后信号消失；LNP-miRNA从2小时起与溶酶体显著共定位，递送持久性增强；LNP-miRNA_dial则早期（30分钟）即进入酸性区室，但后期胞质分布更均匀。单细胞相关性分析进一步证实，透析处理改变了miRNA与溶酶体的时空关联性，提示后处理通过调控内体逃逸途径影响功能性递送。
结论与展望
微流控技术可精确控制LNP的合成，而后处理步骤（超声、过滤、透析等）作为“动力学窗口”独立调控其理化性质与生物学性能。尽管非透析LNP-miRNA具有更优的电动力学参数，但透析处理通过改变细胞内 trafficking 行为，实现更早的miRNA胞内释放与持久性。本研究强调后处理策略在LNP递送系统优化中的关键作用，为基于miRNA的疗法设计提供了理化-生物学性能关联的新范式。未来需聚焦微流控通道表面改性、miRNA包封率提升及内体逃逸效率优化，以推动临床转化。
