《Advanced Science》：Allogeneic Immune Cell Perfusion Inhibits the Growth of Vascularized 3D In Vitro Tumor Models, Induces Vascular Regression and Desmoplasia, but Promotes Tumor Cell Invasion
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本文通过血管化三维生物反应器系统，揭示了同种异体外周血单个核细胞（PBMC）灌注对乳腺癌肿瘤球的多重影响：在诱导肿瘤细胞凋亡、焦亡及血管退化的同时，竟触发外周肿瘤细胞增殖并增强其侵袭性。该研究强调了在构建转化相关肿瘤模型时，需关注供体错配及先天免疫激活的影响，为开发自体系统提供了理论依据。
PBMC Addition to Vascularized Tumor Spheroids Causes Pronounced Vascular Regression
研究团队利用预先建立的具有功能性血管系统的长期稳定介观肿瘤模型，探讨了无血管肿瘤病变血管化后与循环免疫细胞相遇的过程。在三阴性乳腺癌（TNBC）肿瘤球嵌入包含基质和内皮细胞的水凝胶基质，并置于介观且兼容成像的生物反应器中培养7天后，血管网络形成并成熟。第8天，向生物反应器中灌注DiD标记的同种异体外周血单个核细胞（PBMC）。结果显示，PBMC灌注后，免疫细胞迅速粘附于内皮样结构并外渗至水凝胶中，随后定位于血管附近及肿瘤球间的间隙，甚至浸润至肿瘤球内部。在含有肿瘤球的生物反应器中，PBMC灌注引发了快速且显著的血管退化，24小时内血管密度即显著降低，并持续至第15天，导致肿瘤球周围大部分血管丢失。定量分析显示，总血管面积减少59% ± 3.16%，血管互连性丧失82% ± 4.89%，平均血管长度减少53% ± 14.10%。值得注意的是，严重的内皮细胞丢失区域与PBMC聚集热点重叠。相比之下，无肿瘤球的生物反应器中，无论是否灌注PBMC，血管网络均呈现进行性退化，表明肿瘤球的存在初始稳定血管网络，但使其在PBMC暴露时高度易受免疫介导的损伤。
PBMC-Induced Inflammation in the Tumor Microenvironment Causes Cancer Cell Apoptosis, but Promotes an Invasive Phenotype
接下来，研究人员分析了PBMC灌注对肿瘤球的影响。在无PBMC的情况下，血管化肿瘤球显示Ki67+细胞均匀分布，表明癌细胞持续增殖。PBMC灌注后，Ki67+细胞数量显著增加，并主要位于肿瘤球外围，形成致密的增殖区，这可能是肿瘤细胞对球体周边免疫介导炎症的反应。同时，αvβ3整合素+肿瘤细胞数量也增加，提示在炎症条件下肿瘤细胞的粘附和潜在侵袭行为增强。与此一致的是，通过CK8阳性染色特异性识别的癌细胞表现出更强的侵袭性表型，单个细胞和小簇侵入周围微环境。在PBMC灌注的生物反应器中，每个肿瘤球平均检测到28 ± 12个播散的CK8+癌细胞，位于距肿瘤球主体15至215微米处，而无PBMC的对照组中此行为几乎不存在。肿瘤球内的凋亡活性在PBMC存在下也升高，caspase 1+癌细胞数量显著增加，证实了免疫介导的焦亡。此外，caspase 9表达也显著增加。这些肿瘤微环境变化，包括血管通畅性丧失和免疫细胞介导的细胞死亡增加，最终导致肿瘤球尺寸变化：无PBMC的对照组肿瘤球持续生长，而暴露于PBMC的肿瘤球尺寸不变或缩小，这与细胞凋亡和焦亡超过增殖性扩张一致。
Cancer Cells Activate Endothelial Cells, Enhancing Their Interaction With PBMC
通过组织学分析评估免疫-内皮细胞相互作用，重点关注血管活化、增殖和细胞死亡。使用VEGFR2和Ki67评估血管生成和增殖反应。含有肿瘤球的生物反应器中的内皮细胞显示这两种标志物的表达均显著高于无肿瘤对照组，证实了肿瘤诱导的内皮细胞活化。在无肿瘤球的生物反应器中，PBMC灌注对VEGFR2和Ki67表达影响极小。然而，在肿瘤球存在的情况下，PBMC添加导致这两种标志物显著减少，表明血管生成和增殖能力丧失。这些发现表明，经肿瘤预激活的内皮细胞对免疫介导的功能障碍更易感。对血管活化标志物αvβ3整合素的分析显示，其表达在含肿瘤球的生物反应器中升高，与活化内皮表型一致。PBMC灌注进一步增加了αvβ3水平，在肿瘤存在的情况下效果更显著。为理解PBMC诱导的血管退化机制，检测了内皮细胞死亡通路。与内在（线粒体）凋亡相关的caspase 9在含肿瘤系统中表达最低，但在PBMC灌注后增加，尤其是在经肿瘤预激活的血管中。与焦亡相关的炎症小体通路关键效应物caspase 1在PBMC暴露后强烈上调，证实了免疫介导的内皮细胞损伤。肿瘤激活的内皮细胞表现出比非激活对应物更强的caspase 1诱导，突显了其对免疫介导细胞毒性的高度脆弱性。
PBMC Induce a Desmoplastic Reaction in Tumor-Activated Fibroblasts
除了血管分析，还检测了免疫-成纤维细胞相互作用，因为成纤维细胞是肿瘤微环境中炎症的关键调节因子。使用αvβ3整合素、Ki67和癌症相关成纤维细胞（CAF）标志物成纤维细胞活化蛋白（FAP）评估成纤维细胞活化。含有肿瘤球的生物反应器中的成纤维细胞显示所有三种标志物的表达均高于无肿瘤条件，证实了癌细胞对其的激活。PBMC灌注进一步增强了肿瘤预激活成纤维细胞中αvβ3整合素和FAP的表达，而无肿瘤生物反应器中的成纤维细胞仅显示适度增加。与内皮细胞类似，PBMC添加后Ki67+成纤维细胞数量减少，表明尽管活化增加，但增殖能力降低。研究还检测了胶原蛋白I沉积作为成纤维细胞对炎症反应的指标。在无肿瘤生物反应器中，PBMC灌注仅导致胶原蛋白I轻微增加。有趣的是，肿瘤激活的成纤维细胞在PBMC暴露后显示胶原蛋白I水平显著升高。对纤维状胶原蛋白的更深入分析显示，在无PBMC灌注的含肿瘤球生物反应器中，胶原蛋白I/III以离散的热点形式出现，而PBMC灌注导致广泛且互连的胶原网络，局部聚集减少但更均匀地分布在整个基质中。面积分数分析显示PBMC灌注后纤维状胶原蛋白覆盖率升高。凋亡标志物caspase 9和caspase 1的趋势与内皮细胞中的先前发现一致。Caspase 9水平在无PBMC的含肿瘤球生物反应器的成纤维细胞中最低，但在PBMC添加后急剧增加，尤其是在肿瘤激活的成纤维细胞中。Caspase 9在PBMC灌注的含肿瘤球系统中显示最强的上调。这些结果证实，肿瘤激活的成纤维细胞和肿瘤激活的内皮细胞都对免疫介导的细胞毒性更易感，共同促成更具反应性、纤维化和促炎症的基质环境，可能促进组织功能障碍和肿瘤进展。
Tumor Spheroid-Containing Bioreactors Induce Myeloid Persistence and Innate Cytokine Signaling
为了评估动态培养15天后生物反应器系统内免疫细胞的持续存在和组成，进行了免疫细胞标志物CD45（泛白细胞标志物）、CD68（泛单核细胞/巨噬细胞标志物）和CD8（细胞毒性T细胞）的免疫荧光染色。在PBMC条件下，实验终点时均持续检测到CD45+细胞以及CD68+和CD8+细胞，证实了髓系和淋巴系免疫细胞的植入。值得注意的是，CD68+巨噬细胞比CD8+细胞毒性T细胞更丰富，表明肿瘤微环境（TME）内髓系细胞占主导地位。为了分析PBMC添加后1、4、7天水凝胶内免疫细胞亚群的动态和植入情况，进行了流式细胞术分析。流式细胞术能够定量追踪PBMC植入，并显示从含肿瘤球的生物反应器中回收的CD45+免疫细胞绝对数量随时间的变化：PBMC注射后第1天982 ± 392个细胞，第4天1297 ± 532个，第7天239 ± 57个。后期回收细胞数量减少可能反映了免疫细胞浸润触发的ECM沉积增加，影响了有效的酶促生态位解离。然而，从水凝胶中分离的所有单个细胞中，CD45+细胞百分比在PBMC注射后第4天稳定在6.73 ± 2.26%，第7天为6.61 ± 1.48%，表明实验后期持续且稳健的免疫细胞植入。此外，在淋巴和髓系亚群中观察到明显的时间变化。CD19+B细胞最初占CD45+区室的11.20%，灌注后迅速下降，第1天降至0.90 ± 0.76%，第7天进一步降至0.12 ± 0.17%。CD3+T细胞随时间推移同样收缩，从基线36.90%降至第1天23.03 ± 7.63%，第7天稳定在12.83 ± 2.93%。在CD3+区室内，CD4+T辅助细胞显著下降，表明在水凝胶生态位中存活或滞留有限。相比之下，CD8+细胞毒性T细胞在递减的CD3+池中相对比例增加，从第1天2.68 ± 2.66%升至实验终点10.02 ± 4.94%。这些动态表明细胞毒性T细胞亚群在水凝胶内随时间选择性持续存在或富集。髓系亚型显示出向巨噬细胞活化的强烈转变。虽然灌注前无CD68+巨噬细胞，但初始PBMC群体的21%为单核细胞。植入后，单核细胞从56.56 ± 8.39%（第1天）下降至18.34 ± 2.02%（第7天），而CD68+巨噬细胞从0.82 ± 0.49%分别增加至42.23 ± 13.43%。单核细胞的进一步亚型分型显示所有亚群中CD68表达逐渐增加，与单核细胞活化一致。至第7天，中间型单核细胞显示80 ± 20% CD68阳性，非经典单核细胞达到91.67 ± 11.79%，CD16+CD14-low单核细胞从第1天至第7天显著增加，CD68表达为53.1 ± 1.13%。经典单核细胞在实验终点保持较低活化水平27.3 ± 5.51%。这些趋势支持以巨噬细胞分化为主导的髓系转变，并突出了肿瘤生态位内巨噬细胞的稳健和持续植入与活化，强化了它们在塑造该模型免疫景观中的核心作用。
为了进一步表征不同条件下的免疫活性，分析了培养基中分泌的炎症细胞因子表达谱。IL-6、IL-8和MCP-1是表达最丰富的细胞因子之一。值得注意的是，即使在无PBMC和肿瘤球的情况下，它们的表达水平已经很高，并在PBMC添加后进一步增加。IL-6、IL-8和MCP-1的高基线分泌可能反映了应激诱导的促炎症通路（如NF-κB）刺激，可能由水凝胶组成和刚度或长时间动态培养过程中发展的缺氧条件导致。然而，对HIF-1α的后续免疫荧光染色显示条件间无检测差异，表明缺氧不太可能是观察到的细胞因子模式的主要贡献者。此外，几种细胞因子，如GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β和MCP-2，是单核细胞活化和巨噬细胞募集的已知介质，在PBMC条件下选择性上调，表明免疫特异性活化。相对GM-CSF水平在PBMC条件下平均增加至约66%，暗示可能促进浸润髓系细胞扩增和分化的免疫源性信号。值得注意的是，MIP-1α和MIP-1β（均由活化巨噬细胞分泌）在同时含有肿瘤球和PBMC的生物反应器中的表达高于将PBMC引入无肿瘤生物反应器的系统，表明肿瘤源性信号进一步放大了髓系细胞招募和活化，与观察到的CD68+细胞增加一致。这些细胞因子表达模式共同反映了一个髓系主导的免疫特征，其中单核细胞源性细胞可能作为血管和ECM重塑以及更广泛免疫活化的关键介质。其他炎症细胞因子的表达在所有组中保持相对较低。值得注意的是，通常与T细胞活化相关的细胞因子，如IL-2、IL-17、IFN-γ和TNF-α，要么未检测到，要么表达水平极低。整体细胞因子特征支持向先天样反应的转变，以单核细胞招募和基质-免疫串扰为特征，而非协调的细胞毒性T细胞参与。
最后，为了确定PBMC灌注期间循环培养基中升高的哪些细胞因子有助于肿瘤细胞迁移和侵袭，进行了补充的2D和3D侵袭实验。通过此筛选，发现MCP-1和MIP-1α在2D中多个浓度下促进迁移。此外，含IL-6的细胞因子组合在2D中最强地增强伤口闭合，并在3D中增强肿瘤细胞播散。这些发现支持了PBMC灌注下最升高的细胞因子，特别是IL-6，是连接炎症活化与肿瘤细胞侵袭性的关键介质。
