利用精心构建的PzDE-HMM数据库以及从分离株到合成共生体的多尺度验证方法，揭示垃圾填埋场微生物群中降解增塑剂的潜力

《Journal of Hazardous Materials》：Uncovering Plasticizer-Degrading Potential in Landfill Microbiomes with Curated PzDE-HMM Database and Multi-Scale Validation from Isolates to Synthetic Consortia

塑化剂降解机制及填埋场微生物组多级验证研究：构建PzDE-HMM数据库提升降解基因检测敏感性，结合环境宏基因组、分离菌株及合成菌群验证，揭示广谱与专谱降解者共存及协同降解规律，为污染治理提供新工具。

　　

康晓曦|赵泽|朱新宇|朱峰

浙江大学环境与资源科学学院，杭州310058，中国

摘要

增塑剂是广泛使用的添加剂，它们会从塑料产品中渗出并在垃圾填埋场中积累，然而支持其降解的微生物功能仍不甚明了。在这里，我们结合了精心策划的功能注释、底物驱动的富集和分离株水平的验证，来解析垃圾填埋场微生物组中的增塑剂降解过程。我们构建了一个基于49种实验验证过的酶家族的增塑剂降解酶（PzDE）隐马尔可夫模型数据库（PzDE-HMM）。该数据库被应用于五个垃圾填埋场生态位的宏基因组数据，识别出2,219个潜在的增塑剂降解基因，这一数量分别是KofamScan和BLASTp注释方法所识别出的基因数量的3.6倍和19倍。通过使用三种传统的邻苯二甲酸酯（DEHP、DIDP、DBP）和三种非邻苯二甲酸酯增塑剂（DOTP、DOA、ATBC）进行富集处理，显著改变了垃圾填埋场微生物群落和功能基因库的组成，揭示了同时存在广谱降解酶和底物特异性降解酶。从富集培养基中分离出的51个菌株中，有三个代表性菌株的PzDE-HMM预测的基因库、底物范围和降解能力是一致的。由这些菌株组成的合成菌群表现出互补的降解能力，并且比最佳单菌株能更有效地去除多种增塑剂，这表明可以通过组合不同的基因集来增强多底物的降解效果。总体而言，PzDE-HMM注释工作流程和这种多层次的预测-富集-分离-菌群框架揭示了垃圾填埋场微生物组的增塑剂降解和生物修复潜力，为未来以增塑剂为研究对象的微生物组研究提供了一个可重复使用的资源和流程。

引言

全球塑料产量现已超过每年4亿吨，导致塑料废物在环境中持续积累，引发日益严重的污染危机。为了提高塑料产品的柔韧性和耐用性，通常会添加大量增塑剂。由于这些添加剂并未与聚合物骨架共价结合，因此可以通过渗出、挥发和磨损从产品中释放出来，从而在土壤、水体、沉积物和垃圾填埋场渗滤液中广泛检测到它们的存在[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。由于邻苯二甲酸酯（PAEs）与PVC的高度相容性、优异的加工性能和成本优势，它们在全球增塑剂市场中占据主导地位，占据了大部分增塑剂消费量。典型的邻苯二甲酸酯包括二（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯（DEHP）、二丁基邻苯二甲酸酯（DBP）和二异十二烷基邻苯二甲酸酯（DIDP）。随着安全法规的日益严格和对更安全材料需求的增加，非邻苯二甲酸酯增塑剂（NPPs）的研发和应用加速，导致PAEs和NPPs同时被使用。在新兴的NPPs中，己二酸酯（如二（2-乙基己基）己二酸酯（DOA）和柠檬酸酯（如乙酰三丁基柠檬酸酯ATBC）受到了广泛关注。然而，这些替代品在环境中的检出率也在增加，并且现在被认为具有生物累积潜力和更广泛的生态毒性风险，表明它们并非本质上无害[6]、[7]、[8]。因此，必须在一个统一的框架内考虑PAEs和NPPs的环境归趋和微生物转化过程。

垃圾填埋场是增塑剂积累和微生物降解的关键热点。作为各种塑料废物的最终储存场所，垃圾填埋场具有显著的物理化学梯度，并栖息着能够应对芳香族和酯类污染物的多种代谢菌群[9]、[10]。基于培养的研究已经鉴定出多种邻苯二甲酸酯和对苯二甲酸酯的降解菌，包括Comamonas、Pseudomonas、Rhodococcus和Gordonia[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。然而，大多数先前的研究侧重于单一菌株或简化实验条件，而不是垃圾填埋场规模的微生物群落。因此，垃圾填埋场中增塑剂降解菌的生态多样性以及区分广谱降解酶和底物特异性酶的酶家族仍不够明确[16]。

高通量宏基因组测序能够分析复杂微生物组的功能潜力[17]，但增塑剂降解基因的注释仍然是一个主要瓶颈。传统的BLAST类型相似性搜索依赖于成对序列的同一性和覆盖率阈值来控制假阳性结果，因此常常会错过与参考序列差异较大的实验验证过的增塑剂降解酶，从而导致较高的假阴性率。像KofamScan中使用的通用KO基HMM库通常使用广泛的同源性组，其中增塑剂降解酶的代表性不足或被归类为非特异性的水解酶或脂肪酶家族，限制了路径特异性的解析能力。这些限制导致垃圾填埋场宏基因组中增塑剂降解酶的检测不足和功能区分度差，从而推动了使用精心策划的HMM框架。基于实验验证序列构建的HMM框架，并扩展了参考多样性，已被证明可以提高识别外源物质降解酶的敏感性和功能解析度[18]。由于垃圾填埋场宏基因组中含有高浓度的增塑剂和大量的序列新颖性，因此它们为评估精心策划的数据库是否有助于更好地解析增塑剂降解功能以及将这些预测与富集动态和培养菌株联系起来提供了理想的测试平台。然而，目前仍缺乏专门针对增塑剂降解酶的精心策划的数据库，以及将垃圾填埋场规模的宏基因组与富集、分离株和多种类增塑剂菌群相结合的集成方法。

基于这样一个假设：精心策划的基于HMM的工作流程比传统方法能够更敏感和准确地表征增塑剂降解酶编码基因，我们构建了一个增塑剂降解酶（PzDE）隐马尔可夫模型数据库（PzDE-HMM），并将其应用于垃圾填埋场宏基因组数据。在此基础上，本研究探讨了三个问题：（1）与传统工具相比，PzDE-HMM在检测增塑剂降解基因方面的敏感性和准确性提高了多少？（2）垃圾填埋场微生物群落中是否同时存在广谱降解酶和底物特异性降解酶，这些模式在底物驱动的富集过程中是如何被揭示的？（3）是否可以通过将基因组编码的基因库与实验验证的降解表型联系起来，在分离株水平上验证基于PzDE-HMM的预测结果？

为了解决这些问题，我们构建了PzDE-HMM数据库（一个精心策划的酶家族HMM谱集）。我们实施了一个PzDE-HMM注释工作流程，将这些谱集应用于宏基因组的开放阅读框（ORFs），并使用严格的模型特定阈值和后续过滤步骤。然后，我们注释了来自五个垃圾填埋场生态位的宏基因组数据（不同深度的垃圾层、渗滤液和污泥），并将这些预测结果与使用六种代表性增塑剂（DBP、DEHP、DIDP、DOTP、DOA和ATBC）进行的底物驱动富集结果相结合。通过培养分离获得了51个菌株，其中三个菌株进一步进行了测序以评估基因型与表型的一致性。最后，我们组装了合成菌群，以测试互补的基因库是否能够提高多底物的去除效果。总体而言，这种整合的“预测-富集-验证”框架据我们所知是首个专门针对增塑剂降解酶的精心策划的、基于证据的HMM注释工作流程，展示了如何从宏基因组系统地挖掘出垃圾填埋场微生物组，理解并利用其增塑剂降解能力以减轻环境风险，并为未来关于受增塑剂污染环境的研究提供了一个可重复使用的工具。

材料与化学品

为了评估底物驱动的群落重构，我们选择了六种目标增塑剂，这些增塑剂基于市场普及度、主要结构类别的代表性和在本地垃圾填埋场样本中的存在情况。这些增塑剂包括三种传统的邻苯二甲酸酯：二（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯（DEHP）、二异十二烷基邻苯二甲酸酯（DIDP）和二丁基邻苯二甲酸酯（DBP）；以及三种代表性的非邻苯二甲酸酯增塑剂：对苯二甲酸酯（二（2-乙基己基）对苯二甲酸酯（DOTP）、己二酸酯（二（2-乙基己基）己二酸酯（DOA）和柠檬酸酯（乙酰三丁基柠檬酸酯ATBC）。

结果

为了建立下游功能分析的相关环境背景，我们量化了从垃圾填埋场三个不同深度（1米、8米和15米）的垃圾层、渗滤液和下游污泥中收集的六种代表性增塑剂的浓度（图1b）。DEHP在各采样点的含量最高，达到169.0毫克/千克，在渗滤液中的含量超过100毫克/千克，其次是DBP，在渗滤液中的含量特别高（62.4毫克/千克）。其他增塑剂的情况也是如此。

讨论

本研究整合了一个精心策划的PzDE-HMM数据库和注释工作流程、底物驱动的富集方法以及分离株水平的验证，以阐明垃圾填埋场微生物组的增塑剂降解潜力。通过将宏基因组预测结果与群落选择模式和菌株表型联系起来，我们提供了多层面的视角，了解垃圾填埋场微生物群如何响应和代谢结构多样的增塑剂。

这项工作的一个核心贡献是PzDE-HMM

结论

本研究结合了一个精心策划的增塑剂降解酶HMM数据库（PzDE-HMM）、垃圾填埋场宏基因组、增塑剂定义的富集方法、代表性分离株的基因组解析以及简单的合成菌群，来解析垃圾填埋场微生物组的增塑剂降解潜力。PzDE-HMM利用49种实验验证过的酶，识别出五个垃圾填埋场生态位中的2,219个潜在增塑剂降解基因，这一数量分别是KofamScan方法的3.6倍和

环境影响

垃圾填埋场渗滤液和污泥是传统和新型增塑剂的长期储存场所。研究表明，垃圾填埋场微生物组含有多种经过功能验证的增塑剂降解基因和细菌，在环境相关条件下，简单的合成菌群可以进一步增强多种增塑剂的去除效果。精心策划的PzDE-HMM注释工作流程和多层次验证为筛查受环境污染的地点提供了基础。

资金来源

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号22241603）的支持。

作者贡献

F.J. 获得了研究经费并监督了整个研究过程。X.K. 构思了研究方案，设计了实验，分析了数据，并撰写了手稿。Z.Z. 对实验进行了改进并提出了一些建议，并审阅了手稿。X.Z. 审阅并编辑了手稿。F.J. 最终完成了手稿的编辑工作。

CRediT作者贡献声明

康晓曦：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，可视化，验证，软件，资源，方法学，调查，正式分析，数据整理，概念化。赵泽：撰写 – 审稿与编辑。朱新宇：撰写 – 审稿与编辑。朱峰：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢王晓蕾博士在增塑剂富集实验和细菌分离方面的帮助。感谢西湖大学分子科学仪器与服务中心的Chen Yinjuan博士和Zhou Min在实验期间的协助和讨论。同时感谢黄新宇和董傲在HMM模型开发方面的帮助。

注释

作者声明没有利益冲突。

相关内容

实验结果数据集（XLSX格式）

额外的实验细节和方法信息