《Journal of Hazardous Materials》：Passive pumping field-effect transistor microfluidic chip for ultratrace and portable detection of multiple biotoxins in aquatic environments
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本研究设计了一种被动泵送碳纳米管场效应晶体管（CNT-FET）微流控芯片，通过自主流体控制与空间特异性探针修饰实现水环境中五种生物毒素（OA、OTA、ZEN、GT、RT）的同步快速检测，灵敏度达fg/mL级，验证了与传统方法（ELISA/HPLC）的一致性，为便携式多毒素现场监测提供新方案。
唐家军|于宏翔|曾子航|王凯民|赵子军|刘毅伟|青太平|刘晓峰
湖南先进传感与信息技术研究院，湖南省智能碳材料与先进传感重点实验室，湘潭大学，湘潭，湖南411105，中国
摘要
水生环境中多种生物毒素的共存对生态和公共健康构成了重大威胁。然而，由于工作流程繁琐、依赖大型设备以及处理速度慢、便携性差和灵敏度低，同时检测多种生物毒素具有挑战性，这限制了其在现场监测中的应用。本文介绍了一种基于碳纳米管（CNT）的场效应晶体管（CNT-FET）微流控芯片，该芯片结合了选择性探针功能化和多种生物毒素的检测，以及自主流体处理功能，无需外部泵或阀门。该平台能够直接、便携、无标记地快速且灵敏地分析湖水中的多种生物毒素，包括奥卡迪酸、赭曲霉毒素A、玉米赤霉酮、麦角毒素和蓖麻毒素。该芯片具有宽动态范围（1 fg/mL至100 ng/mL）、超低检测限（2.6–9.6 fg/mL）和高回收率（88.3%–116%）。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）和高性能液相色谱（HPLC）等标准分析方法进行的验证证实了该微流控系统的高准确性和可靠性。将CNT-FET阵列与被动泵送微流控芯片相结合，为快速现场生物毒素监测提供了一种实用的方法，对保护环境安全和公共健康具有重要意义。该芯片设计模块化且易于定制，可以通过自主控制特定功能试剂的修改来分析其他环境污染物。
引言
生物毒素对水生生态系统和人类健康构成严重威胁，因为它们常见于真菌、细菌、水生生物和受污水污染的水中，并具有高毒性[1]、[2]。它们的广泛存在和持久性导致在水生环境和产品中的积累，从而进入食物链并引发各种严重后果，包括急性中毒、肝损伤和致癌[3]、[4]、[5]。全球估计约有80%的未经处理的污水直接排放到自然水体中[6]，增加了生态敏感性和生物毒素暴露的风险[7]。水生环境样本中多种生物毒素的共存日益被视为生态安全和公共健康面临的重大挑战。在这些复杂的水系统中，联合毒理效应通常是叠加的或协同的，导致的风险远超过单独毒素的影响[8]、[9]、[10]。当前的检测方法主要针对单一生物毒素，无法捕捉到实际中的多重暴露情况，并忽略了复合毒性的潜在机制相互作用，从而影响了风险评估的准确性。这种狭隘的方法无法同时筛查结构多样的毒素在异质水基质中的存在[11]。高灵敏度的分析技术通常受到高运营成本和功能范围有限的限制，阻碍了其在大规模、高通量水环境监测项目中的可扩展性和实际应用[12]、[13]、[14]。这些限制共同降低了旨在保护生态系统和人类健康的早期预警系统的有效性。迫切需要同时检测水生系统中的多种生物毒素，这强调了准确评估污染水平和减轻复合毒性风险的重要性，为生态完整性和公共健康提供了必要的保障。
目前，多种生物毒素的同时检测主要依赖于生物测定、色谱法、质谱法和免疫测定[15]、[16]、[17]，但每种方法都有其固有的局限性。生物测定可以指示总体毒性水平，但无法区分不同类型的生物毒素或提供精确的定量[18]。此外，个体间的变异性经常导致重复性低，当存在多种生物毒素时，这些测定方法不可靠。色谱法和质谱法为多组分分析提供了高灵敏度和选择性[19]、[20]、[21]。然而，复杂的样品基质可能导致峰重叠和信号抑制，限制了对结构相似衍生物或多种生物毒素的全面覆盖，可能产生错误结果。生物毒素的各种理化性质增加了提取和分离的复杂性，延长了分析时间，而大型仪器则给现场应用带来了挑战。像酶联免疫吸附测定（ELISA）这样的免疫测定方法快速且简单[22]。然而，由于抗体的特异性，检测多种生物毒素需要多个试剂盒。
为了解决这些挑战，研究人员提出了多种同时检测多种生物毒素的新方法。这些方法包括荧光微球法[23]、电化学发光测定[24]、局部表面等离子体共振方法[25]、侧向流动免疫测定[26]、[27]以及超高性能液相色谱与高分辨率质谱联用（UHPLC–HRMS）[28]。然而，这些方法受到灵敏度不足、标记复杂、信号放大技术繁琐和程序耗时的限制，阻碍了对多种微量生物毒素的精确分析。基于场效应晶体管（FET）的生物传感器因其无标记、快速、灵敏和用户友好等特点而被广泛研究[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。然而，大多数生物传感器仍仅限于检测单一生物毒素，在多功能性、精确性和成本效益方面存在挑战。将生物传感器与微流控芯片集成显著提高了多种生物毒素的检测能力，实现了并行分析、高灵敏度、减少样品和试剂消耗以及缩短检测时间[34]、[35]、[36]。这些进展满足了快速和现场检测的需求。然而，传统的微流控系统通常需要外部泵、阀门和管路来控制流体，增加了系统的复杂性和体积，阻碍了便携性[37]、[38]、[39]。相比之下，被动泵送微流控技术无需外部泵或离心机即可实现自维持流动，为便携式、高通量和快速的现场检测多种生物毒素提供了有前景的方法[40]。
本文介绍了一种基于碳纳米管的FET（PP-CNT-FET）微流控芯片，该芯片结合了自维持流动和空间精确的适配体功能化，实现了多种生物毒素的完全集成检测（图1）。选择湖水作为代表性生态样本，其中含有奥卡迪酸（OA）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉酮（ZEN）、麦角毒素（GT）和蓖麻毒素（RT）作为模型目标。样品通过中央入口自动分配到六个侧室中，采用被动泵送策略。每个室对应一个装有特定适配体的CNT-FET传感单元。这种无需外部泵或阀门的被动泵送策略简化了操作，同步了多通道分析，并减少了试剂消耗，而环形几何结构允许空间分辨的探针固定和高效清洗。该平台能够以飞克级别的灵敏度、宽检测范围和高回收率同时检测五种代表性生物毒素。与ELISA和HPLC的对比结果高度一致，突显了该便携式平台的分析稳健性和操作可靠性。通过利用微流控的确定性流体处理能力以及FET阵列的高信号保真度和内在的多路复用能力，该平台超越了传统单分析物方法的基本限制，为实际生物毒素监测提供了一种高效且可扩展的范式。其应用范围不仅限于淡水监测，还扩展到环境和食品分析，为公共健康保护提供了可扩展的方法。
PP-CNT-FET微流控芯片的制备
微流控芯片使用激光雕刻机（PLS6.150D，Universal Laser Systems Inc.）制备。首先用超纯水清洗聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA；江苏汉阳新材料科技有限公司）基底，然后在高纯度氮气下干燥。在两个PMMA表面上使用丙烯酸双面粘合剂（DSA；浙江阳青芯片科技有限公司）。去除保护层并施加均匀的压力
环形PP-CNT-FET微流控芯片的设计
环形PP-CNT-FET微流控芯片由五层组成（图2a）：PMMA盖板、双层DSA粘合剂层、几何定义的功能层和CNT-FET生物传感器阵列。具体的制备过程在“实验方法”部分有详细描述。最终的环形微流控装置（图2b）和CNT-FET阵列（图2c）集成在一起，形成PP-CNT-FET微流控芯片（图2d）。一个环形PP-CNT-FET微流控芯片（图2e）集成了一个主要
结论
本研究介绍了一种PP-CNT-FET微流控平台，用于在水生环境中高灵敏度、无标记地多重检测生物毒素。通过结合自维持流动和空间精确的适配体功能化，该设备成功检测到了五种关键生物毒素——OA、OTA、ZEN、GT和RT——浓度低至fg/mL，在1 fg/mL至100 ng/mL的宽范围内。该生物传感器表现出高线性（R2 > 0.99）和高的回收率（88.3%–116%）
CRediT作者贡献声明
青太平：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、资金筹集。刘毅伟：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、资金筹集。赵子军：方法学、实验研究。刘晓峰：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、资源管理、项目协调、资金筹集。王凯民：方法学、实验研究。曾子航：方法学、实验研究。于宏翔：方法学、实验研究、数据管理。唐家军：撰写 – 初稿
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划（项目编号：2022YFB3204400）、国家自然科学基金（项目编号：22204136、62404193、U22A20617）、湖南省自然科学基金（项目编号：2024JJ6425）、湖南省教育厅科研基金（项目编号：23B0140）、湘潭市科学技术局重点项目（项目编号：ZX-ZD20240001）以及国家工程研究启动基金的支持
