家禽产业是全球食品生产中增长最快的行业之一，这得益于对廉价蛋白质和高效肉类生产系统的需求不断增加。根据联合国粮农组织知识库发布的《2023年肉类市场回顾-新兴趋势与展望》，2023年全球家禽肉产量达到了1.46亿吨，同比增长1.9%，延续了长期增长趋势。[1]预计亚洲和撒哈拉以南非洲地区将实现最显著的增长。同时，北美和欧洲等发达地区由于成本效益和消费者偏好，将继续优先选择家禽肉而非红肉。特别是印度，其家禽产业经历了快速扩张，已成为全球主要的生产国之一[2,3]。然而，这种前所未有的增长也带来了前所未有的废弃物管理挑战。家禽加工厂会产生大量副产品，包括血液、内脏和废水；其中，羽毛是最棘手的部分。羽毛占鸡活重的10%，每年全球产生的羽毛废弃物量超过500万吨，既体积庞大又难以处理[4,5]。
羽毛主要由β-角蛋白组成，这是一种纤维状结构蛋白，赋予材料机械强度、稳定性和环境耐受性。与哺乳动物毛发和羊毛中的α-角蛋白不同，β-角蛋白具有更结晶且紧密交联的结构，这种结构通过氢键、疏水相互作用以及半胱氨酸残基间的二硫键得以稳定[6]。这种分子排列使角蛋白不溶于水，并在自然条件下具有抗酶解和抗微生物降解的特性。羽毛干重的90%以上是角蛋白，其中富含甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等氨基酸，但这些氨基酸通过半胱氨酸残基形成了大量的交联[4]。高含硫量使得角蛋白非常坚韧且不易降解。虽然角蛋白的这种特性对动物有益，但对废弃物利用来说却带来了挑战。
传统的羽毛废弃物处理方法加剧了环境问题。填埋会导致氮和硫化合物渗入土壤和地下水，而分解过程会产生有害气体，如氨和硫化氢。焚烧是一种标准处理方法，但能耗较高，约占家禽加工相关碳排放的11%[7]。除了环境危害外，这些方法还浪费了宝贵的资源。羽毛是一种富含氮的蛋白质来源，将其加以利用可以开发出生物肥料[8]、动物饲料添加剂[9]、化妆品[10]、生物医学支架[11]甚至可降解聚合物[12]。利用这一丰富但未得到充分利用的资源符合循环生物经济的理念，即把废弃物转化为高价值产品，造福工业和环境。
多年来，人们开发了多种从羽毛中提取角蛋白的方法，但每种方法都有其局限性。使用硫化钠或硫醇的还原方法可以有效断裂二硫键，但往往会导致丝氨酸和色氨酸等敏感氨基酸的降解[13]。使用氢氧化钠或氢氧化钾的碱性水解方法会破坏氢键，但可能损坏肽链，导致水解产物质量较低[14]。过氧乙酸或过氧化氢的氧化方法也能溶解角蛋白，但需要使用危险试剂并产生有害排放物[15]。热液[16]和微波辅助[17]方法可以加速角蛋白的溶解，但需要高能耗，且常导致氨基酸降解。在生物方法中，利用角蛋白酶进行酶解被认为是最环保的方法，因为它避免了使用有害化学物质并保留了生物活性肽。然而，由于天然角蛋白的交联程度过高，酶解效果往往不理想。每种技术在特定条件下都有其优势，但没有一种方法同时满足高效率、环境可持续性和经济可行性的要求。
在这种背景下，离子液体（ILs）作为一种有前景的绿色溶剂出现了，适用于处理富含角蛋白的生物质。离子液体定义为在100°C以下仍保持液态的盐类，由大体积有机阳离子和有机或无机阴离子组成，可以针对性地破坏生物聚合物中的特定相互作用。它们具有低蒸气压、高热稳定性和可调的溶剂化性能，成为挥发性有机溶剂的替代品[18]。对于角蛋白而言，离子液体通过破坏氢键、溶解疏水区域和断裂二硫键来松解蛋白质的刚性结构[19,20]。多项研究表明，基于咪唑鎓和胆碱鎓的离子液体在优化条件下可将角蛋白从毛发、羊毛和羽毛中溶解率达到90–95%[19,21,22]。然而，许多离子液体价格昂贵、合成过程复杂或生物降解性有限。为克服这些限制，研究人员专注于使用低成本前体合成的质子型离子液体（PILs）。例如单乙醇铵甲酸盐（[MEA][HCOO]）在溶解角蛋白方面表现出优异效率，同时还具备生物降解性、可回收性和相对简单的合成工艺。最新研究表明，[MEA][HCOO]在130°C下数小时内即可溶解人类头发，使其成为处理羽毛的理想选择[23]。
尽管离子液体在破坏角蛋白方面有效，但要实现完全转化，还需将其水解为氨基酸和肽，这些才是下游应用所需的最终产品。这时，微生物角蛋白酶发挥了重要作用。角蛋白酶由Bacillus licheniformis和Streptomyces fradiae等细菌和真菌分泌，是一种能够切割角蛋白肽键的专性蛋白酶。它们在温和温度和碱性条件下发挥作用，将溶解后的角蛋白分解为生物活性肽和游离氨基酸。角蛋白酶水解产物富含亮氨酸、缬氨酸和赖氨酸等必需氨基酸，在动物营养、化妆品和制药领域具有价值。然而，单独使用酶通常无法完全降解完整的羽毛，因为β-角蛋白的刚性结构限制了酶的渗透。
这种局限性促使人们将离子液体预处理与微生物酶解相结合。这种组合方法具有协同效应：离子液体首先破坏角蛋白的紧密交联结构，使其更易于被酶分解；随后角蛋白酶高效地将蛋白质水解为可溶性氨基酸。这种方法的优势显而易见：它避免了使用有害试剂，在相对温和的条件下操作，且产量优于单独使用任一方法。此外，它符合可持续性目标，因为质子型离子液体可由廉价且可生物降解的前体合成，微生物发酵依赖可再生资源。通过应用响应面方法（RSM）和中心复合设计（CCD）等统计优化方法，可以精细调整工艺参数，从而在降低成本和环境影响的同时提高效率。
在这项工作中，我们开发了一种新的混合工艺，结合了可生物降解的离子液体[MEA][HCOO]的溶解能力和Bacillus licheniformis产生的微生物角蛋白酶的特异性，实现了羽毛的有效转化。我们合成了[MEA][HCOO]并对其进行了表征，同时通过SDS-PAGE和酶学检测验证了角蛋白酶的产生和活性。通过实验设计优化了这种离子液体-酶系统，并通过RP-HPLC定量了氨基酸产量（尤其是甘氨酸和丝氨酸），并通过ninhydrin测定法进行了验证。这种综合方法为将家禽废弃物转化为高价值氨基酸提供了可靠、可扩展且环保的途径，有助于农业、化妆品、生物医学和材料工程等领域的可持续生物加工和循环经济实践。
