《CNS Neuroscience & Therapeutics》：The Rostral Ventrolateral Medulla Input to Central Amygdala Regulates Anxiety-Like Behaviors in Mice for Chronic Light Exposure
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本研究发现慢性光照（CL）通过激活延髓头端腹外侧区（RVLM）至中央杏仁核（CeA）的神经通路，诱发小鼠焦虑样行为及血压升高。研究综合运用逆向病毒示踪、化学遗传学（hM4Di）与光遗传学（eNpHR3.0/ChrimsonR）技术，揭示RVLM→CeA环路在光诱导焦虑中的关键作用，为环境光照相关情感障碍的机制研究提供了新视角。
ABSTRACT
Background
环境光照暴露与焦虑障碍发展的关联日益受到关注。延髓头端腹外侧区（RVLM）作为调节交感神经输出和血压（BP）的关键脑干中枢，在焦虑患者中常出现自主神经失调。高血压是焦虑相关病理的公认加重因素。虽然多项情绪障碍研究报道了中央杏仁核（CeA）向脑干区域的异常投射，但CeA是否接收RVLM的输入以及RVLM兴奋对慢性光照（CL）诱导焦虑症状的影响程度尚不明确。
Methods
研究采用慢性轻度光照（250–300 lx）持续4周诱导小鼠焦虑样行为。通过尾套系统检测血压，ELISA法检测血浆儿茶酚胺水平，免疫荧光法分析RVLM和CeA区神经元c-fos表达。结合逆向病毒示踪、化学遗传学和光遗传学技术，在自由活动小鼠中调控RVLM-CeA通路，探究其对慢性光照诱导焦虑样行为的影响。
Results
慢性光照导致小鼠血压升高和神经元活动增强，其中RVLM区的激活程度显著高于CeA。化学遗传抑制RVLM神经元可明显缓解CL诱导的焦虑样行为。光遗传抑制RVLM→CeA通路能减轻CL暴露小鼠的焦虑表型，而在正常小鼠中光遗传激活该通路可快速引发焦虑样行为。
Conclusions
RVLM→CeA环路内增强的兴奋性信号是慢性光照诱导焦虑样行为的基础，揭示了RVLM调节光相关情感功能障碍的新机制。
1 Introduction
焦虑障碍是以病理性恐惧、警觉性增高和回避行为为特征的精神疾病，全球终身患病率超过30%，带来显著的多系统疾病负担。现代社会中，夜间过度暴露于人工光源（ALAN）会扰乱内源性昼夜节律，与情绪障碍发病率上升相关。慢性光照可改变前额叶皮层、海马、下丘脑和脑干等情绪调节脑区的神经元活动。交感神经系统和血压在焦虑和抑郁等情绪障碍中常升高，高血压与焦虑共病率高达15%–50%。RVLM作为维持交感神经张力和基础血压的关键脑干区域，是介导慢性光照情绪效应的候选脑区。解剖和功能研究表明，RVLM与边缘系统结构（包括CeA）存在双向连接，但该通路在慢性光诱导焦虑中的作用尚未明确。
2 Materials and Methods
2.1 Chronic Light Exposure Procedure
采用250–300 Lux慢性轻度光照4周诱导小鼠负性情绪行为。对照组为12-h光/12-h暗循环，CL组为24-h持续光照。使用雄性C57BL/6J小鼠（6–8周龄），所有实验符合NIH实验动物护理和使用指南。
2.2 Stereotaxic Surgery, Virus Injection and Optical Fiber Implantation
小鼠经戊巴比妥钠麻醉后，立体定位注射AAV病毒至RVLM（前囟后6.60 mm，中线旁1.30 mm，脑膜下5.55 mm）和CeA（前囟后1.07 mm，中线旁2.75 mm，脑膜下4.6–4.8 mm）。病毒注射体积100–400 nL，速率40 nL/s。光遗传刺激采用473-nm蓝光/589-nm黄光（5 mW，15-ms脉冲，20 Hz）。
2.3 Chemogenetic Manipulations
化学遗传实验采用AAV病毒表达hM4Di受体，腹腔注射CNO（2 mg/kg）30-min后进行行为测试。
2.4 Tissue Processing, Immunofluorescence and Imaging
小鼠经4%多聚甲醛灌注后，取脑制作30–40-μm冠状切片，使用兔抗c-Fos（1:1000）和小鼠抗Cre（1:1000）抗体进行免疫荧光染色，尼康A1激光共聚焦显微镜成像。
2.5 Open Field Test (OFT)
在50×50×20-cm透明丙烯酸场地中进行30-min自由探索，记录中心区域停留时间和总运动距离。
2.6 Elevated Plus Maze (EPM)
高架十字迷宫由中央平台（5×5-cm）、两个闭合臂（35×5×15-cm）和两个开放臂（35×5-cm）组成，记录5-min内开放臂停留时间和总入臂次数。
2.7 Sucrose Preference Test (SPT)
通过1%蔗糖溶液和普通水消耗量计算蔗糖偏好率，反映快感缺乏行为。
2.8 Measurements of BP, HR and Plasma Hormone Examination
采用尾套系统（BP-2010AUL）无创测量收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、平均动脉压（MAP）和心率（HR）。ELISA法检测血浆糖皮质激素、褪黑素、皮质酮和儿茶酚胺（去甲肾上腺素、肾上腺素）水平。
2.9 Quantification and Statistical Analysis
数据以mean±SEM表示，组间比较采用Student's t检验或单因素ANOVA，p<0.05为显著差异。
3 Results
3.1 Mice in CL Emerged Anxiety Symptoms and Elevated Blood Pressure
CL小鼠在OFT中心区域停留时间和EPM开放臂停留时间显著减少，蔗糖消耗量降低，自发活动减少。血浆糖皮质激素和皮质酮水平升高，褪黑素无显著变化。CL组SBP升高约107-mmHg，DBP、MAP及去甲肾上腺素、肾上腺素水平均升高。
3.2 Chronic Light Exposure Markedly Increased Neuronal Excitation in the CeA and RVLM Regions
逆向病毒示踪显示RVLM与CeA存在双向纤维连接。c-fos表达分析表明，CL小鼠RVLM和CeA区神经元激活显著增强，且RVLM的激活程度高于CeA。
3.3 Chemogenetic Inhibitions of the RVLM and CeA Alleviated Anxiety-Like Behaviors in CL Mice
化学遗传抑制RVLM（AAV2/9-TH-hM4Di-mcherry）或CeA（AAV2/9-hSyn-hM4Di-mcherry）神经元活动后，CL小鼠的焦虑样行为明显改善，且RVLM抑制效果优于CeA。
3.4 Optogenetic Manipulation of the RVLM→CeA Pathway Partially Alleviated Anxiety-Like Behaviors in the CL Mice
光遗传抑制RVLM→CeA通路（AAV-DIO-eNpHR3.0-EGFP）可缓解CL小鼠焦虑表型，而光遗传激活该通路（AAV-DIO-ChrimsonR-mcherry）能在正常小鼠中诱发焦虑样行为。
4 Discussion
本研究证实慢性光照通过增强RVLM→CeA环路的兴奋性驱动焦虑样行为。RVLM作为自主神经调节的关键节点，在环境应激下与边缘系统形成正反馈环路，共同维持交感过度激活和情感障碍。该发现为高血压与焦虑共病机制提供了新解释，提示靶向RVLM-CeA通路可能为光相关情绪障碍提供治疗策略。
4.1 Limitation
研究未探讨副交感神经活动的作用，且仅使用雄性小鼠，未来需验证性别差异及CeA→RVLM反向通路的功能。
Author Contributions
Jing JN、Tan X和Wang WZ设计研究；Jing JN完成实验；Yuan C进行图像分析；所有作者参与数据分析和论文撰写。
Acknowledgments
感谢王义政提供实验平台，研究受国家自然科学基金（32100954、82270467）资助。
