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OX40/OX40L靶向抗体通过阻断异源三聚体形成抑制特应性皮炎，计算模型揭示不同抗体作用机制差异。
Kelsey Nolden|Yuanjun Shi|Victor S. Batista|Christopher G. Bunick
威斯康星医学院，生物化学系，美国密尔沃基，威斯康星州，
摘要
特应性皮炎是一种慢性炎症性皮肤病，影响着全球超过2亿人。尽管该病的病因复杂，但免疫检查点分子OX40和OX40L在疾病发展中起着关键作用。最近的临床试验表明，针对OX40的抗体rocatinlimab（KHK4083/AMG-451）和telazorlimab（GBR-830/ISB-830），以及针对OX40L的抗体amlitelimab（KY1005）能够显著改善特应性皮炎的症状。然而，这些抗体与OX40和OX40L结合的表位尚未明确，因此它们具体破坏OX40-OX40L信号传导的机制也不清楚。为了解决这个问题，我们进行了计算建模来预测抗体-蛋白质复合物，并对其相互作用界面进行了表征。使用MM-PBSA方法分析了抗体结合界面周围5 ?范围内的特定OX40或OX40L残基间相互作用的结合自由能，并进行了残基级能量分解分析。我们的分析表明，rocatinlimab和amlitelimab通过空间阻碍直接抑制OX40-OX40L的相互作用，而telazorlimab则破坏了一个关键的OX40-OX40L键。总体而言，这项工作为皮肤病学中新兴的OX40和OX40L靶向生物制剂的表位提供了分子层面的特征描述。
引言
特应性皮炎（AD）是一种慢性炎症性皮肤病，影响着高达五分之一的儿童和二十分之一的成人（Silverberg和Hanifin，2013；Wollenberg等人，2016；Langan等人，2020）。除了慢性皮肤红斑、刺激、瘙痒和疼痛外，AD患者还常常遭受负面心理影响（Schonmann等人，2020；Kern等人，2021），因此有效的长期治疗对于提高患者的生活质量至关重要。AD的发病是多因素的，其特征是2型免疫反应过度活跃，导致皮肤屏障功能受损、慢性炎症和皮肤微生物群失调（Nakahara等人，2021）。除了2型细胞因子（IL-4、IL-13、IL-31）外，胸腺基质淋巴生成素（TSLP）、IL-22和IFNγ也参与了AD的发病机制。最近的研究发现，免疫检查点分子OX40和OX40L在AD的发病中起着关键作用（Ito等人，2005；Seshasayee等人，2007；Wang和Liu，2007；Ilves和Harvima，2013；Halim等人，2018；Furue和Furue，2021）。OX40（TNFRSF4，CD134）是一种共刺激型1型跨膜细胞表面受体，在抗原刺激和CD28-CD80/CD86相互作用共刺激下在活化的T细胞上表达；它在细胞外呈延长折叠（图1）。OX40识别并与OX40L（TNFSF4，CD252）相互作用，后者属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族；OX40L表达在抗原呈递细胞（APC）表面，呈更球形的折叠（图1）。
从生理学角度来看，OX40L是一种2型跨膜蛋白，在APC表面以同三聚体的形式存在，由三个单独的OX40分子结合（Compaan和Hymowitz，2006）（图2）。因此，功能性的OX40-OX40L相互作用是一个异三聚体复合物。这种异三聚体相互作用使每个OX40受体的细胞质尾部能够招募TNFR相关因子（TRAF）2、3和5，这些因子随后与下游激酶相互作用，促进克隆CD4+和CD8+ T细胞的扩增，并通过效应T细胞和记忆效应T辅助细胞（Th1和Th2细胞）的分化增强促炎T细胞反应，同时释放细胞因子（Croft，2010）。OX40的共刺激主要参与T细胞增殖的后期阶段和细胞存活的延长，从而允许克隆细胞的积累，并根据初始的细胞因子反应以反馈方式偏移免疫反应（Croft等人，2009）。
在AD中，OX40的共刺激促进了2型炎症反应。这进一步通过Th2细胞分泌IL-4和IL-13得到增强，这两种细胞因子通过下调皮肤屏障蛋白（如丝聚蛋白和loricrin）直接导致皮肤屏障功能障碍（Furue和Furue，2021）。皮肤屏障功能障碍，包括kallikreins 5和7的过度活跃，进一步偏向2型细胞因子反应。一个关键因素是TSLP，IL-25和IL-33也有贡献（Furue和Furue，2021）。TSLP直接刺激人类树突状细胞上的OX40L表达（Ito等人，2005），使用针对OX40L的抗体抑制TSLP可以在小鼠模型中预防TSLP诱导的炎症（Seshasayee等人，2007）。
异常的Treg细胞活性，无论是由于功能受损还是由于在湿疹性皮肤病变中的异常积累，可能在AD的发病中起作用。一般来说，Treg细胞通过促进对自身抗原的耐受性和调节抗炎细胞因子的分泌来防止过度的免疫反应（Agrawal等人，2011）。最近的研究表明，OX40的共刺激直接阻断了Foxp3+ Treg的抑制活性，导致效应CD4+ T细胞群体的增加。这可能是由于Foxp3基因表达减少、Foxp3+ Treg活性直接受到抑制以及T细胞分化为Foxp3+ Treg受到阻止（Vu等人，2007；Croft等人，2009；Zhang等人，2018；Fu等人，2020）。因此，OX40-OX40L相互作用可能通过多种机制促进AD的发病。
与AD类似，哮喘和溃疡性结肠炎主要是由Th2细胞驱动的炎症过程，这表明它们可能通过抑制OX40或OX40L而受益（Fuss和Strober，2008；Akdis等人，2020）。相反，最近的研究表明克罗恩病与Th17细胞激活增加和Treg细胞群体减少有关（Jaeger等人，2021）。同样，银屑病的发病机制源于Th17细胞的异常激活，这是由于IL-23的产生增加（Rendon和Sch?kel，2019；Li等人，2020；Liu等人，2021）。尽管在银屑病皮肤病变和克罗恩病患者的活检中观察到OX40+细胞浓度增加（Stüber等人，2000；Guo等人，2019），但OX40在这些疾病中的具体作用仍不清楚，一些研究表明OX40的共激活减少了Th17的分化，而其他研究表明OX40增加了促Th17细胞因子（Liu等人，2021）。鉴于OX40的潜在共同上游激活作用，OX40L和OX40都是针对影响皮肤、胃肠道和肺部的多种自身免疫和炎症性疾病的有希望的治疗靶点。因此，评估OX40-OX40L抑制在AD、银屑病和溃疡性结肠炎中的临床试验在第一和第二阶段显示出希望（Papp等人，2017；Guttman-Yassky等人，2019b、2019a、2023；Kierkus等人，2020；Furihata等人，2021；Weidinger等人，2023、2024）。
鉴于OX40-OX40L相互作用在AD发病中的直接作用，抑制这一信号轴可能防止疾病进展并提供症状缓解。目前有多种针对OX40-OX40L界面的疗法正在开发中，并处于不同的临床试验阶段（表1）。这些疗法包括针对OX40的抗体rocatinlimab（KHK4083；NCT03096223，NCT03703102）（Nakagawa等人，2020；Guttman-Yassky等人，2023）和telazorlimab（GBR-830；NCT02683928和NCT03568162）（Guttman-Yassky等人，2019b），它们作为拮抗剂并已完成第二b阶段试验，以及IMG-007（NCT05984784）和BAT6026（NCT06094179），以及针对OX40L的拮抗剂amlitelimab（KY1005；NCT03754309和NCT05131477）（Saghari等人，2022；Weidinger等人，2023）。Rocatinlimab也在青少年患者（NCT05633355和NCT05704738）和与局部钙调神经磷酸酶抑制剂联合使用的成人患者中进行研究（NCT05724199）。其中一些生物制剂也评估了其在哮喘和炎症性肠病中的治疗用途，在这些疾病中，OX40-OX40相互作用也会产生类似的过度2型免疫反应（Gauvreau等人，2014；Akdis等人，2020；Kierkus等人，2020）。
到目前为止，关于针对OX40或OX40L的结构基础的信息有限，导致目前临床试验中使用的OX40-OX40L抑制剂的分子作用机制存在显著的知识空白。在这里，我们描述了OX40-OX40L相互作用界面的结构特性，并通过计算建模和分析了rocatinlimab、telazorlimab和amlitelimab的表位。我们还表征了预测的结合表面，以测试生物制剂表位的结构差异可能解释临床疗效和副作用谱差异的假设。
部分内容
表位位置和化学性质
确定了OX40和OX40L的配体表位，并将其映射到OX40-OX40L异三聚体的分子表面上（图3、图4A、图5A、补充视频1），揭示了两个不同的OX40-OX40L相互作用界面和一个对称的OX40L-OX40L界面。OX40L蛋白的对称三聚体构成了复合物的中心核心，三个OX40蛋白围绕OX40L三聚体核心排列。这些分子界面包含几个高度保守的残基
讨论
利用计算方法，我们建模并分析了正在开发用于治疗AD的OX40和OX40L靶向生物制剂的表位。我们的结果表明，针对OX40（rocatinlimab、telazorlimab）和OX40L（amlitelimab）的生物制剂直接破坏了OX40-OX40L异三聚体复合物的形成。有趣的是，所有关于rocatinlimab和amlitelimab表位的模型都集中在一个主要位置上。然而，对于telazorlimab有两个预测的表位
共复合物结构预测、分子动力学模拟和MM/PBSA分析
使用AlphaFold3服务器根据每个蛋白质或抗体的fasta序列生成了OX40–rocatinlimab、OX40–telazorlimab和OX40L–amlitelimab的共复合物结构（Jumper等人，2021）。使用AmberTools23的tLEaP模块准备了蛋白质的拓扑和参数文件（Salomon-Ferrer等人，2013；Case等人，2023，2025）。随后使用NAMD进行了分子动力学（MD）模拟，每个共复合物有三次独立的400 ns重复实验伦理声明
本研究没有涉及人类受试者，因此不需要知情同意。编写本手稿时没有使用任何AI或LLM工具。
利益冲突
KAN、YS和VSB没有相关的利益冲突。CGB曾担任AbbVie、Apogee、Connect BioPharma、Eli Lilly、Incyte、LEO Pharma、Pfizer、Sanofi和Regeneron的研究员或顾问。本研究未与这些公司合作，也未获得它们的资助。作者贡献
概念化：KN、CGB；数据整理：KN、YS；正式分析：KN、YS；资金获取：VSB、CGB；调查：KN、YS、VSB、CGB；方法学：KN、YS、CGB；资源：KN、YS；软件：KN、YS；监督：VSB、CGB；验证：KN；可视化：KN、YS；写作 - 原始草稿：KN、YS；写作 - 审稿与编辑：KN、YS、VSB、CGB
未引用的参考文献
CCP4 CCPN 4-, 2023；Furue和Mihoko，2021；Kierkus等人；Team Rs. RStudio，2019。致谢
我们感谢耶鲁大学皮肤科对这项工作的支持。KN通过MCW MSTP获得了支持，该计划部分由NIGMS T32-GM080202资助。这项工作还得到了美国国立卫生研究院（NIH）/国家关节炎和肌肉骨骼及皮肤疾病研究所（NIAMS）的支持，授予编号为R01 AR079428的奖项，授予CGB。
