《Scientific Reports》：Effect of sonication and protease inhibitors on Elisa quantification of selected proteins in bovine udder tissue homogenates
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为解决样本前处理方案差异对ELISA检测结果可靠性的影响，研究人员系统评估了机械匀浆(MH)、蛋白酶抑制剂(PI)及超声(S)处理对牛乳腺组织中CSN1、LTF和ALP定量的影响。研究发现MH+PI+S组合会导致蛋白浓度显著降低，而单纯MH法可获得最高检测值，且ALP对处理方式最敏感。该研究为乳腺相关蛋白检测的标准化提供了关键实验依据。
在乳腺生物学和疾病研究中，准确量化组织中的蛋白质浓度至关重要。酶联免疫吸附试验（ELISA）因其高灵敏度和特异性被广泛采用，但样本前处理流程的差异——如是否使用机械匀浆（MH）、添加蛋白酶抑制剂（PI）或进行超声破碎（S）——可能导致检测结果出现显著偏差。目前，不同实验室采用的方案各异，缺乏标准化指导，这直接影响了数据的可比性和可重复性。尤其在对牛乳腺组织进行α-酪蛋白（CSN1）、乳铁蛋白（LTF）和碱性磷酸酶（ALP）等关键蛋白的定量分析时，前处理步骤对最终蛋白回收率的影响尚未明确。此外，乳腺的健康状态（如是否遭受凝固酶阳性葡萄球菌感染）是否会影响不同前处理方法的效率，也是一个亟待解答的问题。为了解决这些方法论上的不确定性，并为相关研究提供可靠的实验依据，研究人员在《Scientific Reports》上发表了题为"Effect of sonication and protease inhibitors on Elisa quantification of selected proteins in bovine udder tissue homogenates"的研究论文。
本研究主要采用了四种不同的样本前处理方案对牛乳腺组织 parenchyma 进行处理，包括单纯机械匀浆（MH）、机械匀浆结合蛋白酶抑制剂（MH+PI）、机械匀浆结合超声（MH+S）以及三者联用（MH+PI+S），并利用 sandwich ELISA 技术对 CSN1、LTF 和 ALP 进行了定量分析。研究队列包含22头奶牛（11头健康，11头感染凝固酶阳性葡萄球菌）的乳腺组织样本。
不同前处理方案对蛋白浓度的影响
研究人员系统比较了四种前处理方案对三种目标蛋白定量浓度的影响。结果一致表明，与单独使用机械匀浆（MH）相比，添加蛋白酶抑制剂（PI）和/或进行超声处理（S）均会导致检测到的蛋白浓度降低。其中，MH+PI+S 联合处理方案导致所有三种蛋白的检测值均为最低。这一趋势在不同健康状态的样本中均保持一致，说明前处理方式本身是影响蛋白回收率的关键因素。
不同蛋白对处理方式的敏感性差异
研究进一步分析了不同蛋白对前处理方法的敏感性。结果显示，碱性磷酸酶（ALP）的浓度受处理方式的影响最为显著，表明其对实验操作条件更为脆弱。相比之下，α-酪蛋白（CSN1）的表现则相对稳定。这种差异提示，在同时检测多种蛋白时，需要根据目标蛋白的特性对前处理方案进行个性化优化。
乳腺健康状态对蛋白浓度及前处理效果的影响
通过比较健康与感染凝固酶阳性葡萄球菌的乳腺组织样本，研究发现感染样本中的α-酪蛋白（CSN1）水平显著高于健康样本。然而，乳铁蛋白（LTF）和碱性磷酸酶（ALP）的浓度则未受到感染状态的显著影响。更重要的是，研究并未发现乳腺的健康状态会改变不同前处理方案对蛋白定量结果的影响模式，即前述各种处理方案的效果在健康和感染组中是一致的。
研究结论与意义
本研究明确证实，牛乳腺组织匀浆的样本前处理方法（包括机械匀浆、蛋白酶抑制剂的使用和超声处理）显著影响后续 sandwich ELISA 对α-酪蛋白（CSN1）、乳铁rin（LTF）和碱性磷酸酶（ALP）的定量结果。单纯使用机械匀浆（MH）可获得最高的蛋白检测浓度，而添加蛋白酶抑制剂和超声处理，特别是三者联用，会降低检测值。碱性磷酸酶（ALP）是对处理方式最敏感的蛋白。此外，虽然乳腺的感染状态会影响CSN1的本底水平，但并不干扰不同前处理方案的相对效果。
该研究的核心意义在于强调了样本制备流程标准化对于获得可靠、可重复的ELISA结果的重要性。研究结果提示，在优化检测方案时，需要权衡防止蛋白降解（使用PI）和充分破碎组织（使用超声）的潜在益处与它们可能带来的蛋白损失或构象改变的风险。对于牛乳腺组织及相关蛋白的研究而言，本研究为选择最适前处理方案提供了直接实验证据，有助于提高不同研究之间数据的可比性，推动该领域研究方法的规范化。
