《Immunology》：Latent Neoehrlichia mikurensis Infections May Be Reactivated in Patients With B-Cell Lymphomas Treated With Rituximab
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这篇研究揭示了蜱传细菌新埃立克体（Neoehrlichia mikurensis）可在B细胞免疫缺陷患者中潜伏，并经利妥昔单抗（rituximab）治疗后重新激活。通过对97名B细胞淋巴瘤患者的监测，研究发现8%的患者存在潜伏感染，其中一半在B细胞抑制后发生再激活。研究证实感染患者体内存在特异性穿孔素（perforin）阳性的Th1和CD8+ T细胞及扩增的γδ T细胞群体，为理解该细菌的潜伏机制及免疫防御提供了新见解。
引言
新埃立克体（Neoehrlichia mikurensis）是一种蜱传细胞内细菌，属于无形体科（Anaplasmataceae）。自2010年首次报道人类感染病例以来，已知其可引起新埃立克体病（neoehrlichiosis），典型症状包括发热、盗汗、全身不适和局部疼痛。超过一半的患者会出现无法解释的血管和血栓栓塞事件，这可能与该细菌对血管内皮细胞的嗜性有关。由于该细菌无法在无细胞培养基中生长，且目前尚无血清学检测方法，血液样本的PCR检测是当前唯一的诊断选择。主要传播途径是蜱叮咬，输血也可能传播。B细胞是对抗新埃立克体感染的关键部分，这在B细胞免疫功能受损的患者（如使用利妥昔单抗等B细胞抑制药物治疗的恶性B细胞淋巴瘤、风湿病或其他自身免疫性疾病患者）中病情严重性上得到证实。本研究旨在探究新埃立克体是否会引起潜伏感染，并在B细胞防御受损时重新激活。
结果
在接受利妥昔单抗治疗的淋巴瘤患者中新埃立克体再激活的发生率
研究组包括97名患者，其中三分之二为男性，中位年龄69岁。患者罹患17种不同类型的恶性B细胞淋巴瘤，最常见的是弥漫性大B细胞淋巴瘤。百分之四（4/97）的患者在开始利妥昔单抗治疗后新埃立克体PCR检测呈阳性，其中两名在治疗中期（开始治疗后第79天和第105天），两名在治疗结束后（第215天和第222天）。另有四名患者（4%）在研究开始时，即在接受利妥昔单抗治疗前，新埃立克体PCR已呈阳性。这八名患者均未意识到自己感染，也未表现出任何新埃立克体感染的症状或临床体征。感染患者的八个PCR检测结果具有相对较高的循环阈值（CT）值（中位数36；范围27-39），表明血液中细菌浓度较低。所有新埃立克体检测呈阳性的患者均接受口服多西环素治疗3周，并通过PCR验证清除了感染。
感染新埃立克体的淋巴瘤患者携带新埃立克体特异性T细胞反应，而未感染的淋巴瘤患者则无
对利妥昔单抗治疗前收集的冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMC）进行了针对新埃立克体的T细胞反应性测试。首先，我们评估了对应于新埃立克体P44/Msp2蛋白的混合肽段在八名感染患者中激发T细胞增殖的能力。感染患者的CD3+ T细胞和CD8+ T细胞对两种浓度的P44/Msp2肽段产生增殖反应。这些患者的CD4+ T细胞对P44/Msp2肽段仅产生微弱增殖。感染患者在比较两种肽浓度时也表现出剂量依赖性的T细胞增殖反应。相比之下，在八名未感染的淋巴瘤对照患者中观察到低水平或无T细胞增殖，这些对照患者是通过匹配淋巴瘤类型和性别为每位感染患者选择的；仅5/8名患者可能进行年龄匹配。通过流式细胞术分析的T细胞增殖代表性示例如图所示。在潜伏感染患者中，对较高浓度P44/Msp2肽段产生增殖反应的CD3+ T细胞比例范围为1.2%至17%，而在八名匹配对照患者中的七名中该比例缺失（0%），除了第七对中的对照患者有1.9%的T细胞增殖。
感染新埃立克体的淋巴瘤患者比未感染的淋巴瘤患者拥有大10倍的γδ T细胞群体
使用飞行时间流式细胞术（CyTOF）对静息未刺激的CD3+ T细胞进行多参数表型分析显示，感染患者比匹配的未感染淋巴瘤对照患者携带更大的γδ T细胞群体。聚类分析显示，八名感染患者拥有三个大的γδ T细胞群体，这些群体在未感染淋巴瘤患者群体中也存在但显著更小。所有三个T细胞群体（命名为群体1-3）均为CD8+并表达穿孔素、CD28、IL-7受体（CD127）和细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）。群体1与群体2在CD45RA和趋化因子受体CXCR3（CD183）表达上不同，但共享CD161（杀伤细胞凝集素样受体B1）表达，而群体3是三个群体中唯一表达CXCL10（也称为IFN-γ诱导蛋白-10，IP-10）的。此外，群体3仅由八名感染患者中的一名携带，而该患者反而缺乏群体1和2。对感染患者和未感染对照患者中三个T细胞群体大小的详细分析显示，群体1被八分之七的感染患者携带，占其总CD3+ T细胞群体的0.5%至10%（平均3.0%）。相比之下，同一群体在未感染淋巴瘤患者的CD3+ T细胞中占0%-0.5%（平均0.2%）。类似地，群体2的平均大小在潜伏感染个体中占总CD3+ T细胞群体的5.0%，但在未感染淋巴瘤患者中仅为0.5%。总之，群体1和2在感染患者组中的平均大小是未感染淋巴瘤患者组的10倍。
P44/Msp2刺激感染新埃立克体患者的T细胞可在体外诱发CXCL10和IFN-γ反应
聚类分析还揭示了经P44/Msp2肽段刺激后，T细胞群体中CXCL10和IFN-γ表达水平的增加。在感染患者组中，有四个T细胞群体的CXCL10表达水平在体外P44/Msp2肽段刺激下剂量依赖性增加；这些群体在未感染对照组患者中对肽段刺激无反应。表达上调的CXCL10的T细胞群体包括CD4+ Th1细胞（群体1）、效应记忆CD4+ Th1细胞（群体2）和CD8+效应记忆T细胞（群体3和4）。所有四个群体均表达穿孔素和CTLA-4。在感染患者组中鉴定出两个T细胞群体，其IFN-γ表达在P44/Msp2肽段刺激后增加，但在未感染对照组中缺失。这些群体包括一个表达穿孔素、弱表达IFN-γ的CD4+ Th1细胞群体（群体1）和一个对应于终末效应T细胞群体的CD8+ T细胞群体（群体2）。在相应的T细胞培养上清液中，通过ELISA未检测到CXCL10或IFN-γ。
讨论
许多细胞内病原体可以在人类宿主体内长期持续存在。驻留在免疫保护性生态位（血管内皮就是一个例子）的病原体可引起潜伏感染，并受免疫系统控制。一旦免疫防御受损，例如立氏立克次体（Rickettsia prowazekii）和布里尔-津瑟病（Brill-Zinsser disease）中的衰老、潜伏结核病（TB）中的肿瘤坏死因子（TNF）抑制，或巨细胞病毒（CMV）再激活中的T细胞抑制，潜伏感染可能重新激活，病原体复制增加，如果不进行治疗，可能进展为有症状的疾病。这与我们在当前研究中对八名淋巴瘤患者的观察结果一致，他们都 unknowingly 感染了新埃立克体，并且缺乏新埃立克体病的典型体征，如发热、疼痛或血管事件，或任何其他可归因于感染性疾病的症状或体征。我们对结果的解释是，8%的研究患者存在潜伏性新埃立克体感染，其中一半个体（研究人群的4%）显示出潜伏感染重新激活的证据，即在开始利妥昔单抗治疗前血液中细菌水平不可检测，而在开始B细胞抑制治疗后血液中可检测到细菌水平。似乎可能，如果不是全部，一些患者会进展为有症状的新埃立克体感染（新埃立克体病），如果感染未被根除。这没有发生，因为所有患者都接受了多西环素治疗，并在完成抗生素疗程后PCR转为阴性。
我们希望排除这四名推测经历了潜伏性新埃立克体感染再激活的患者在研究期间通过新的蜱叮咬感染了新发（de novo）感染的可能性。为了解决这个问题，并为我们的潜伏理论提供支持，我们采用了诊断潜伏结核病的策略。IFN-γ释放试验和纯化蛋白衍生物（PPD）试验是诊断潜伏结核病的金标准，这两种测试都依赖于检测结核特异性T细胞反应，即T细胞受结核抗原刺激产生IFN-γ以及T细胞募集到皮内PPD沉积部位。我们面临的挑战是开发一种新埃立克体特异性T细胞测试，同时考虑到对新埃立克体免疫原性蛋白身份的认知缺乏。进一步的困难是新埃立克体无法在无细胞培养基中繁殖，而只能在蜱细胞系或人内皮细胞系上培养，这限制了获得用于T细胞测试的纯细菌提取物。因此，我们选择了对最近发表的三个新埃立克体临床分离株的全基因组序列进行计算机（in silico）分析。我们选择的174个氨基酸的P44/Msp2蛋白似乎对新埃立克体具有特异性，因为该蛋白的最接近同源物由浣熊中发现的新埃立克体（Ca. N. lotoris）携带，而浣熊在欧洲不存在。我们测试了一种T细胞刺激方案，该方案已用于研究SARS-CoV-2的T细胞反应，并发现它对于研究新埃立克体的T细胞反应也有用。
八名潜伏感染淋巴瘤患者（但非未感染对照患者）的T细胞在P44/Msp2肽段刺激后明确地以增殖和CXCL10及IFN-γ上调的方式作出反应。主要是CD8+ T细胞对肽段刺激产生增殖反应，而CD4+ Th1和CD8+ T细胞均上调了CXCL10和IFN-γ的表达。一个不变的特征是，所有对新埃立克体有反应的T细胞群体都表达细胞毒性分子穿孔素。Th1细胞和细胞毒性CD8+ T细胞是对抗细胞内病原体免疫的标志性特征，正如我们在当前研究中所示，这也适用于人类新埃立克体感染。穿孔素阳性的细胞毒性T淋巴细胞已被证明对于清除内皮细胞内病原体康氏立克次体（Rickettsia conorii）的感染至关重要。Th1细胞通过合成IFN-γ以及为细胞毒性T淋巴细胞和B细胞的活化、克隆扩增以及（就B细胞而言）抗体合成提供帮助来发挥其抗菌活性。事实上，抗体已被证明通过以下方式参与针对几种细胞内病原体的免疫防御：（i）它们不仅能在细胞外环境中中和微生物，还能在细胞内环境中中和微生物；（ii）它们能够通过抗体介导的细胞毒性促进细胞毒性淋巴细胞杀死细胞内微生物。
在潜伏感染患者中，γδ T细胞很突出，但对P44/Msp2肽段刺激无反应，只有一个例外：一个表达CXCL10的γδ T细胞群体。γδ T细胞对P44/Msp2肽段无反应并不意外，因为γδ T细胞是先天性样细胞，优先识别非蛋白质来源的小磷酸化分子以及应激细胞呈现的各种自身抗原，以一种不依赖MHC、不需要抗原呈递的方式，这与适应性免疫的经典αβ T细胞相反。γδ T细胞利用许多不同的机制来对抗细胞内感染，包括分泌裂解性穿孔素以及产生Th1细胞因子如IFN-γ和CXCL10，所有这些特征都出现在本研究中描述的γδ T细胞群体中。然而，γδ T细胞也识别转化细胞，尤其偏爱B细胞起源的肿瘤，这与我们对恶性B细胞淋巴瘤患者的研究高度相关。尽管如此，感染新埃立克体的淋巴瘤患者比患有相同类型淋巴瘤的未感染患者拥有大得多的γδ T细胞群体。这表明这些扩增的γδ T细胞群体是由潜伏性新埃立克体感染产生的，而不仅仅是对B细胞淋巴瘤的反应。
总之，当前研究中呈现的结果支持了潜伏性新埃立克体感染存在并可在B细胞免疫受抑制时重新激活的假设。这为我们最近报道的新埃立克体可能具有致淋巴瘤能力的发现提供了可信度，即在某些患者中长期潜伏性新埃立克体感染后可能引起B细胞转化和淋巴瘤发展。未来，我们旨在开发用于测量针对新埃立克体的抗体反应的血清学检测，这将使我们能够定义抗新埃立克体抗体的保护水平，低于此水平则存在无症状潜伏性新埃立克体感染变为有症状的风险。在新埃立克体流行地区（例如欧洲大部分地区和北亚），在开始B细胞抑制治疗前对B细胞淋巴瘤患者进行潜伏性新埃立克体感染筛查可能也是必要的，以避免这些感染的重新激活，从而防止潜在严重的血栓栓塞和血管事件。
