《The Lancet Microbe》：Parasite clearance in patients with
Plasmodium vivax monoinfection treated with artesunate in Cambodia: an observational secondary analysis of trial data
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为评估间日疟原虫(Plasmodium vivax)对青蒿素类药物的敏感性，研究团队在柬埔寨开展了一项前瞻性研究，对87名患者（共161次感染）进行青蒿琥酯单药治疗，并系统监测寄生虫清除动力学。结果发现，所有感染在3天内均被清除，但6%的感染其清除半衰期>5h，达到间日疟原虫对青蒿素部分耐药标准。基因表达分析显示，清除缓慢的虫株在治疗早期出现血红蛋白内吞与消化相关基因的下调，这可能会减少青蒿琥酯的激活，为临床监测和防控青蒿素联合疗法(ACT)耐药性提供了新依据。
在人类与疟疾的漫长斗争中，以青蒿素为基础的联合疗法(ACT)是当前最有力的武器。然而，这个武器正面临一个日益严峻的挑战：耐药性。在恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)中，青蒿素“部分耐药”现象（表现为寄生虫清除延迟）自本世纪初在柬埔寨西部被报道后，已迅速扩散，对全球疟疾防控构成严重威胁。与恶性疟原虫相比，间日疟原虫(Plasmodium vivax)是导致人类疟疾的第二大元凶，2022年造成超过690万病例。由于它更难被彻底消除，且缺乏成熟的体外培养系统，人们对其青蒿素敏感性知之甚少。一个关键问题悬而未决：在青蒿素耐药性已对恶性疟疾治疗构成威胁的同一地区，间日疟原虫是否也出现了类似的“抵抗”迹象？为了回答这个问题，一个由Kieran Tebben、Virak Eng、Dynang Seng、Baura Tat、Lionel Brice Feufack-Donfack、Agnes Orban、Rominea Yeat、Jeremy Salvador、Sitha Sin、Katie Ko、Nimol Khim、Claude Flamand、Cecile Sommen、Dysoley Lek、David Serre、Jean Popovici等研究人员组成的国际团队，在柬埔寨开展了一项深入的研究，其成果发表于《The Lancet Microbe》杂志。
为了精准评估间日疟原虫对青蒿琥酯的体内反应，研究团队在柬埔寨磅士卑省开展了一项开放标签、单中心的临床试验。研究纳入了87名经qPCR（定量聚合酶链式反应）确诊为单纯性间日疟感染的患者，所有患者均接受为期7天、每日2 mg/kg体重的青蒿琥酯单药治疗。治疗期间，研究人员在服药前（0小时）及服药后1、2、4、8、16小时，以及随后每天（24小时间隔）密集采集血样，通过显微镜和qPCR动态监测寄生虫密度，以计算寄生虫清除99%所需时间(PCT99)和清除斜率半衰期。此外，研究还利用全基因组测序技术，对28个感染样本的寄生虫DNA进行了分析，并重点检测了10个可能与青蒿素反应相关的候选基因的编码区多态性。同时，通过对31个感染（包括16个清除缓慢和15个清除快速的感染）在治疗前及治疗后多个时间点的血样进行RNA测序(RNA-seq)，深入剖析了寄生虫在药物压力下的基因表达动态变化。
研究结果
所有感染均被成功清除，但清除速率存在显著异质性。 分析涵盖的161次间日疟感染均被青蒿琥酯成功清除，所有患者在第3天时经显微镜检查已无寄生虫。然而，对158次感染（3次因初始虫密度过低无法分析）的清除动力学分析显示，寄生虫清除速率存在广泛差异。清除斜率半衰期的分布呈现长尾特征，最佳模型解释为两个高斯分布的混合。尤为重要的是，9次（6%）来自6名不同患者的感染，其清除半衰期超过了5小时，这达到了世界卫生组织(WHO)定义的恶性疟原虫对青蒿素部分耐药的标准。这些清除缓慢的感染，其PCT99也显著长于清除半衰期小于5小时的感染。分析还发现，清除时间与患者年龄、体重、服药剂量、初始虫密度或感染中环状体（早期发育阶段）的比例均无显著相关性。
清除缓慢与特定患者或感染特征无关，提示为寄生虫内在因素。 统计学分析未发现清除半衰期与患者个体存在显著关联。对6名拥有多次感染（且至少包含一次缓慢清除）的患者进行深入分析发现，这些患者体内同时存在清除缓慢和清除正常的感染，表明缓慢清除表型并非由宿主特异性因素（如免疫力或药物代谢基因多态性）单一决定。
基因表达分析揭示缓慢清除虫株存在延迟且独特的转录反应。 对治疗前后寄生虫转录组的动态监测发现，清除快速的虫株在给药后2小时内即发生广泛的基因表达变化，涉及泛素-蛋白酶体通路和翻译相关基因的下调。而清除缓慢的虫株对青蒿琥酯的基因表达反应存在明显延迟：在给药后1小时内几乎无变化，主要变化发生在给药后2至4小时。除了在更大程度上表现出与快速清除虫株共享的蛋白酶体和翻译相关基因下调外，缓慢清除虫株还展现出独特的转录特征。其中，多个参与血红蛋白内吞（如VPS45、PIP3）和消化（如falcilysin、vivapain 3 [VP3]）的关键基因在治疗后被显著下调。此外，在给药4小时后，调控配子体发育的关键转录因子AP2-G和AP2-G5的表达出现上调。值得注意的是，与恶性疟原虫青蒿素耐药相关的Kelch13蛋白的同源基因在间日疟原虫中并未发生差异表达。
基因组学分析未发现与缓慢清除表型强相关的编码区突变或特定遗传谱系。 对28个感染样本的全基因组测序数据分析显示，缓慢清除的虫株在遗传关系上并未聚集在一起，也未在10个候选基因的编码区发现能明确区分快、慢清除表型的错义突变。一个有趣的案例来自28号患者：其初始感染（清除半衰期1.76小时）和44天后复发的感染，经测序证实为基因型完全相同的虫株，但复发感染的清除却显著缓慢（半衰期4.6小时），这提示缓慢清除表型可能并非由稳定的遗传突变决定，而可能受表观遗传或环境因素调控。
研究结论与讨论
本研究首次系统描绘了间日疟原虫对青蒿琥酯治疗的体内反应全景。尽管所有感染均被成功清除，但研究明确揭示了部分柬埔寨间日疟原虫虫株存在清除延迟现象，其中6%的感染达到了目前用于定义恶性疟原虫青蒿素部分耐药的半衰期阈值。这一发现虽未与治疗失败直接关联，但具有重要的预警意义：清除延迟可能使寄生虫在青蒿琥酯血药浓度下降后仍能存续，特别是在治疗依从性不佳的情况下，从而为联合用药中长效伙伴药物（如哌喹、甲氟喹）耐药性的产生创造条件，最终威胁以青蒿素为基础的联合疗法的效力。
研究从分子机制层面提供了潜在解释。基因表达数据表明，缓慢清除的虫株在接触药物后，下调了血红蛋白代谢途径的相关基因。由于青蒿琥酯需要被寄生虫消化血红蛋白产生的血红素(haeme)激活才能发挥药效，血红蛋白代谢的减缓可能导致药物激活效率降低，从而使寄生虫暴露于更低浓度的活性药物之下，这或许是清除延迟的重要原因之一。这与恶性疟原虫中已报道的青蒿素耐药机制存在相似之处。此外，AP2-G等基因的上调提示药物治疗可能影响了寄生虫的有性生殖倾向，这可能增加传播风险，值得后续关注。
在遗传层面，本研究未发现缓慢清除表型由某个明确的耐药基因突变驱动，也未发现这些虫株属于某个特定的克隆谱系。同一基因型虫株在不同感染中表现出不同的清除速率，进一步暗示环境或表观调控因素可能在其中扮演关键角色。当然，本研究也存在样本量相对有限、监测间隔可能略微高估清除时间等局限性，需要在更大规模的研究中验证。
总而言之，这项研究发出了一个重要信号：在与恶性疟原虫青蒿素耐药起源地相同的柬埔寨，间日疟原虫也已显示出清除延迟的迹象。这种异质性反应可能与寄生虫代谢重编程有关。尽管尚未导致临床治疗失败，但这种“缓慢撤退”的趋势若不加警惕和监控，可能会侵蚀当前主力抗疟方案的根基。因此，加强对间日疟原虫治疗效果的监测，深入研究其耐药机制，对于捍卫来之不易的抗疟成果、最终实现消除疟疾的目标至关重要。
