《Biochemistry Research International》：Candidate Biomarkers for Crohn’s Disease: Hub Genes and Regulatory miRNAs Identified by Bioinformatics Analysis
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本研究通过整合分析多个GEO数据集，识别出与克罗恩病（CD）密切相关的60个差异表达基因，并筛选出三个枢纽基因（CXCL1、CXCL2、CXCR2）及两个关键miRNA（hsa-miR-1-3p、hsa-miR-335-5p）。文章认为这些分子在CD的发病和进展中扮演重要角色，尤其CXCL1/CXCL2/CXCR2轴通过介导趋化因子信号和细胞因子-受体相互作用，调控中性粒细胞募集和炎症级联反应，有望成为CD的新型诊断生物标志物和治疗靶点，为理解其分子机制和开发精准医疗策略提供了新视角。
引言
克罗恩病（Crohn’s disease, CD）是一种慢性的复杂炎症性疾病，可累及整个消化道，最常见于末端回肠。其确切病因尚不明确，目前普遍认为与遗传易感性、环境因素和免疫失衡密切相关。CD的临床表现多样，常见症状包括腹痛、腹泻、发热和体重减轻，并可伴有肠外表现，严重影响患者身心健康并增加社会医疗负担。尽管生物制剂的应用显著改善了临床预后，但部分患者仍会出现治疗不应答。因此，深入探索CD的分子机制，识别新的诊断标志物和治疗靶点至关重要。
材料与方法
本研究从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库下载了三个数据集（GSE179285、GSE186582、GSE112366），分别包含33个CD样本与8个健康对照、196个CD样本与25个健康对照，以及141个CD样本与26个健康对照。利用GEO2R在线工具（整合GEOquery和Limma包）鉴定CD患者炎症回肠黏膜样本与健康对照回肠样本之间的差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），筛选标准为|Log2FC| > 1且校正后p值 < 0.05。通过R包ClusterProfiler对DEGs进行基因本体（Gene Ontology, GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络，并导入Cytoscape软件进行可视化，利用其插件cytoHubba通过十种算法（如MCC、Degree等）识别枢纽基因（Hub Genes）。基于miRTarBase数据库预测与枢纽基因相关的microRNA（miRNA），并利用Cytoscape构建miRNA-枢纽基因调控网络。最后，使用R软件的“pROC”包绘制受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线并计算曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）来评估枢纽基因的诊断性能，同时利用“glmnet”包构建最小绝对收缩和选择算子（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator, LASSO）回归模型以降低过拟合风险。
结果
差异表达基因鉴定
对三个数据集的综合分析共鉴定出60个在CD样本中表达显著改变的DEGs，其中44个为上调基因，16个为下调基因。韦恩图展示了三个数据集中上调与下调基因的交集情况。
GO与KEGG富集分析
GO分析显示，上调基因主要富集在胶原蛋白细胞外基质、白细胞迁移、内质网腔、细胞外基质结构成分等条目；下调基因则显著富集于细胞顶端部分、顶端质膜、刷状缘、烯烃化合物代谢过程等。KEGG通路分析表明，DEGs在细胞因子-细胞因子受体相互作用、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用、蛋白质消化与吸收等通路中显著富集。
PPI网络构建与枢纽基因识别
对DEGs进行PPI网络分析，并利用Cytoscape的MCODE插件筛选出两个重要的基因簇模块。通过cytoHubba插件的十种算法进行评分和交集分析，最终鉴定出三个枢纽基因：CXCL1、CXCL2和CXCR2，它们在CD患者中均呈上调表达。
枢纽基因分析
这三个枢纽基因均属于CXC趋化因子家族。CXCL1（C-X-C motif chemokine ligand 1）具有吸引中性粒细胞的趋化特性，在炎症中起关键作用。CXCL2（C-X-C motif chemokine ligand 2）由活化的单核细胞和中性粒细胞产生，在炎症部位表达。CXCR2（C-X-C Chemokine Receptor Type 2）是白细胞介素-8（IL-8）等的受体，其中和作用可激活中性粒细胞。功能富集分析显示，这三个基因主要参与趋化因子介导的信号通路、对趋化因子的反应、细胞对趋化因子的反应等生物过程；KEGG通路则富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用，以及幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号传导。
miRNA-枢纽基因调控网络的建立
利用miRTarBase和Cytoscape构建了包含28个节点（25个miRNA，3个mRNA）和27条边的miRNA-mRNA调控网络。其中，hsa-miR-1-3p和hsa-miR-335-5p各与两个靶基因（CXCL2和CXCL1；CXCL2和CXCR2）相关联，被识别为潜在的关键调控miRNA。
枢纽基因验证与LASSO模型构建
通过ROC曲线分析评估了三个枢纽基因在三个独立数据集中的诊断性能。在所有数据集中，每个枢纽基因的AUC值均大于0.7，显示出良好的预测性能。特别是在GSE179285数据集中，CXCL1和CXCL2的AUC值分别达到0.970和0.936。联合ROC曲线分析进一步证实了这三个基因组合具有良好的诊断价值。LASSO回归模型的结果也表明，CXCL1、CXCL2和CXCR2的表达与CD的发生发展相关。
讨论
本研究鉴定的60个DEGs及其富集通路与CD的病理特征高度一致，如细胞外基质重塑、白细胞浸润、肠上皮细胞极性破坏和吸收功能障碍等。三个枢纽基因CXCL1、CXCL2和CXCR2构成了一个协同的调控轴。CXCL1和CXCL2作为配体，通过共同作用于受体CXCR2，形成“趋化因子-受体”信号复合体，强力招募中性粒细胞至肠道炎症部位，加剧黏膜屏障的炎症浸润和损伤。这种协同效应可能是CD难治性炎症的基础。CXCR2的广泛表达还提示其可能参与CD的肠外并发症（如血管病变和关节炎症）的调节。研究还识别出两个关键miRNA：hsa-miR-1-3p和hsa-miR-335-5p。hsa-miR-1-3p可能通过调节Smad通路影响肠上皮屏障功能和炎症反应；而hsa-miR-335-5p的表达下调可能与CD患者肠道炎症相关的癌变风险增加有关，因为它对细胞周期相关基因如MAPK10的抑制解除，可能促进上皮-间质转化（EMT）和细胞异常增殖。
局限性与未来方向
本研究的局限性包括部分数据集样本量较小且分布不平衡，可能引入异质性。此外，所鉴定的关键生物标志物的功能相关性和具体分子机制（如CXCL1/CXCL2/CXCR2轴的调控级联以及miRNA与枢纽基因间的靶向关系）仍需通过体外和体内功能实验进一步验证。未来的研究需要在大型、平衡的独立临床队列中进行验证，并深入探索这些分子在调控肠道炎症、上皮屏障功能以及CD炎症-癌变转化中的作用，以期将其转化为可靠的CD诊断生物标志物或治疗靶点。
结论
本研究通过生物信息学整合分析，鉴定出60个DEGs、三个枢纽基因（CXCL1、CXCL2、CXCR2）和两个关键miRNA（hsa-miR-1-3p、hsa-miR-335-5p）。这些枢纽基因主要通过细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路介导CD的肠道炎症进展，形成协同调控轴。相关miRNA则可能参与肠上皮屏障功能和CD相关癌变风险的调控。这些发现深化了对CD发病分子机制的理解，并为CD的早期诊断、疾病活动度评估和预后预测提供了有潜力的候选生物标志物。
