基于适配体的CRISPR/Cas12a系统用于无需扩增即可检测活的致病性弗莱克斯纳志贺菌（Shigella flexneri）

《Microchemical Journal》：Aptamer-based CRISPR/Cas12a system for amplification-free live pathogenic Shigella flexneri detection

CRISPR/Cas12a与aptamer结合无需核酸提取即可快速检测活菌，灵敏度达225 CFU/mL，且能区分活死菌，优于传统qPCR方法。

Juan Geng|张安然|龙金兆|金月飞|陈帅胤|段光才

中国郑州大学公共卫生学院流行病学与健康统计系

摘要

志贺菌病是许多发展中国家面临的严重公共卫生问题。目前检测志贺菌的金标准仍然是细菌培养，但这种方法步骤繁琐且培养时间较长。CRISPR检测系统在传染病诊断中表现出优异的性能。然而，传统的基于CRISPR的检测平台虽然灵敏度高，但依赖于核酸提取和扩增，并且无法区分样本中的活菌和死菌。本文将适配体的强结合特异性与CRISPR/Cas12a的强大信号放大能力相结合，建立了一种新型检测方法，能够高灵敏度、高特异性地检测活的弗氏志贺菌（S. flexneri），无需进行核酸提取或扩增。实验结果表明，CRISPR/Cas12a检测系统的最佳条件为：Cas12a浓度为50 nM，反应缓冲液使用NEBuffer r2.1，Cas12a与crRNA的浓度比为1:1。此外，细菌与适配体阻断剂杂交置换反应的最佳条件为Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），室温下孵育1小时。在上述条件下，基于适配体的CRISPR/Cas12a系统比qPCR方法具有更高的灵敏度和特异性，同时还能判断细菌的存活状态。该方法可在1.5小时内检测到低至225 CFU/mL的活弗氏志贺菌。总之，本研究开发的活弗氏志贺菌检测平台为细菌性痢疾及其他细菌感染的监测和控制提供了一种快速检测技术。

引言

作为许多地区主要的志贺菌物种，弗氏志贺菌（S. flexneri）在全球范围内广泛分布，是高度传染性腹泻疾病的主要致病菌[1]、[2]、[3]。弗氏志贺菌对公共卫生构成严重威胁。因此，临床样本中这种病原体的快速、灵敏检测对于有效干预至关重要。目前金标准的检测方法是细菌培养，但耗时较长，通常需要2-3天。传统的病原菌检测技术，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、聚合酶链反应（PCR）和定量实时PCR（qPCR），虽然具有检测快速、灵敏度高和特异性好的优点，但也存在以下缺点：（1）依赖昂贵的实验室设备；（2）操作复杂，需要专业技术人员；（3）无法区分细菌的生死状态。因此，开发简便、低成本且高度灵敏的活菌检测技术至关重要。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关系统（Cas）不仅被用于基因组编辑，还应用于医学核酸诊断等多个领域，已成为下一代分子检测技术。代表性的平台包括SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking，使用Cas13a）和DETECTR（DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter，使用Cas12a）进行核酸检测。Cas效应蛋白在引导RNA的指导下能够识别并破坏目标核酸。特别是Cas12a效应蛋白可以通过短的原间隔序列（PAM）识别并结合双链DNA（dsDNA）及单链DNA（ssDNA）。这种结合会引发Cas12a的构象变化，激活其DNase活性，切割目标DNA并降解周围的非目标单链DNA。因此，通过监测Cas12a切割非特异性单链DNA报告探针产生的荧光信号来实现目标DNA的检测。然而，传统的CRISPR/Cas系统通过识别核酸来检测细菌，因此其应用仅限于基于核酸的检测方法，且仍依赖于提取和扩增步骤。因此，我们需要一种新的机制来实现核酸与非核酸之间的信号传递。

适配体是一种短的单链DNA或RNA分子，能高特异性地结合多种目标，包括小分子或蛋白质，通常通过指数富集（SELEX）技术系统筛选获得[4]、[5]。适配体被称为“化学抗体”，相比传统抗体具有多种优势，如体积小、热稳定性高、生产成本低、易于扩增和免疫原性低[6]、[7]。将适配体与强大的信号放大策略（尤其是CRISPR-Cas系统）结合，代表了分子诊断领域的重大突破。在这种配置中，适配体作为高特异性的目标捕获器，结合后触发构象变化或启动下游反应，激活Cas酶的切割活性。这种协同作用利用了适配体的精确靶向能力和CRISPR的强大切割能力，从而实现极高的灵敏度和特异性，为复杂临床样本中病原体和低丰度生物标志物的早期检测开辟了新途径。

本文旨在结合适配体生物传感器的优势和CRISPR/Cas12a的切割活性，开发一种无需核酸提取的活弗氏志贺菌检测方法。该检测系统如图1所示，包含两个关键组件：一种特异性捕获弗氏志贺菌细胞的适配体，以及一种用于调节CRISPR/Cas12a系统活性的阻断链。当适配体与活弗氏志贺菌结合时，会触发阻断链从杂交双链DNA（Hy-dsDNA）中释放，释放的阻断链激活Cas12a/crRNA复合物，使其切割荧光淬灭剂（FQ）标记的单链DNA报告探针，产生可测量的荧光信号[8]。该系统无需核酸提取和扩增，克服了传统CRISPR检测方法的局限性，显著扩展了其在活细胞检测和分析中的应用范围。

试剂与材料

本研究中使用的弗氏志贺菌（ATCC 12022）、大肠杆菌（E. coli ATCC 25922）、宋内志贺菌（S. sonnei）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）均为实验室保存的菌株。所有寡核苷酸由中国北京BGI基因组公司合成。HiScribe? T7快速高产量RNA合成试剂盒（NEB #E2050S）、Engen Lba Cas12a和NEBuffer?（r1.1、r2.1、r3.1、rCutsmart）购自美国马萨诸塞州Ipswich的新英格兰生物实验室（New England Biolabs）。

高效稳定阻断剂的筛选

本研究中使用的适配体、阻断剂和crRNA的序列见表S1。琼脂糖凝胶电泳结果显示适配体与阻断剂形成了杂交链，如图2A所示。此外，通过将Cy5荧光团和BHQ2淬灭剂分别连接到阻断剂和适配体的末端进行荧光标记，如图2B和C所示，Blocker5显示出最高的荧光强度

细菌检测方法

传统的细菌检测方法（如培养和生化鉴定）虽然准确性和存活率评估能力强，但操作繁琐且耗时[12]、[13]、[14]。近年来，为了开发快速、现场可用的病原菌检测工具，多种分子方法应运而生[15]。基于核酸的技术（以定量PCR（qPCR）为代表）已在分子生物学领域得到广泛应用

结论

本研究开发了一种基于Cas12a-适配体的生物传感器，无需扩增即可直接检测活病原体，利用适配体的特异性结合和CRISPR的程序化激活机制。该检测方法对弗氏志贺菌的检测灵敏度和特异性很高，检出限为225 CFU/mL。此外，该方法相比其他基于CRISPR的适配体平台具有显著优势，能够区分活菌和死菌。

CRediT作者贡献声明

Juan Geng：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据整理、概念设计。张安然：初稿撰写、数据分析、数据整理。龙金兆：审稿与编辑。金月飞：审稿与编辑。陈帅胤：审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金申请。段光才：监督、资源协调。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号82073618）的支持。