《Microchemical Journal》：Catalytic assembly induced reverse transcription mediated Cas12a/split-crRNA cleavage for accurate and sensitive abdominal aneurysm related miRNA analysis
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miRNA检测|等温扩增|Cas12a/split-crRNA|单碱基错配特异性|腹部主动脉瘤
沙·杰汉（Shah Jehan）| 徐一燕（Yiyan Xu）| 王莹（Ying Wang）| 杨博涵（Bohan Yang）| 孙和成（Hecheng Sun）| 韩松（Song Han）| 彭超（Chao Peng）| 吴振（Zhen Wu）| 张鹏（Peng Zhang）| 王海阳（Haiyang Wang）
广东省广州市广州医科大学第一附属医院血管外科，邮编510120，中国
摘要
微小RNA（miRNAs）是腹主动脉瘤的潜在生物标志物，但由于其序列长度较短、丰度较低以及序列相似性较高，检测仍然具有挑战性。在这项研究中，我们开发了一种基于双环DNA探针的等温扩增检测方法，该方法结合了催化组装驱动的逆转录和Cas12a/split-crRNA复合物的切割活性，实现了直接、灵敏和特异的miRNA分析。目标miRNA启动两个双环DNA探针的杂交，进而引发催化组装和T7 RNA聚合酶驱动的逆转录，生成支架RNA。该支架RNA与Cas12a蛋白结合，而目标miRNA作为间隔RNA形成活性Cas12a/split-crRNA复合物。当被单链DNA触发剂激活后，该复合物会切割荧光团-淬灭剂报告基因，产生可量化的荧光信号。该方法对miRNA-21的检测限为0.31 fM，并表现出高特异性，能够有效区分单碱基错配。该方法还成功应用于人血清中miRNA-21的定量检测，回收率在97.3%至107.2%之间，检测结果与RT-qPCR测量结果高度一致。临床样本分析显示，腹主动脉瘤患者的miRNA-21表达水平高于健康对照组。通过结合双目标识别和一锅法等温扩增，该方法提供了一种快速（<100分钟）、灵敏且特异的miRNA检测平台，具有在床旁诊断和临床生物标志物评估中的巨大潜力。
引言
腹主动脉瘤（AAA）是一种危及生命的血管疾病，定义为腹主动脉的永久性局部扩张，具有高达80%的破裂风险[1]，[2]。目前的诊断方法主要依赖于医学成像技术，但这些方法往往在疾病相对晚期才能检测到AAA，并且缺乏分子特异性。相比之下，微小RNA（miRNAs）因其循环中的高稳定性、对早期病理变化的敏感性以及反映特定疾病机制的能力而成为有前景的生物标志物。最近的研究强调了miRNAs在AAA发病机制中的重要作用，miRNAs是作为基因表达的关键转录后调节因子[3]，[4]。例如，miRNA-21在人类AAA组织和实验性小鼠模型中均显著上调，表明其在疾病进展中起补偿作用[5]，[6]。临床前研究表明，miRNA-21可调节平滑肌细胞行为，从而影响AAA的发展和扩张。这些发现使miRNAs（如miRNA-21）成为临床诊断和预后的潜在生物标志物。然而，由于miRNAs的序列长度较短、拷贝数变化较大以及相关miRNA家族之间的序列同源性较高，其检测和分析存在相当大的挑战。因此，开发高灵敏度和特异性的miRNA检测平台对于推进对AAA的生物学理解和治疗策略至关重要。
尽管聚合酶链反应（PCR）因其高灵敏度[7]，[8]，[9]仍被视为核酸检测的金标准，但其广泛应用受到设备成本高昂和需要熟练人员的限制。因此，迫切需要开发创新的检测平台，以解决当前系统在快速响应、成本效益和用户可访问性方面的问题。除了依赖扩增的策略外，还报道了一系列无需扩增的光学传感平台用于miRNA检测[10]，[11]，[12]。这些方法通常利用纳米材料增强的信号或光物理转导机制，具有简化工作流程和快速读数的优势。然而，许多无标记或无需扩增的光学方法在实现临床样本中低丰度miRNA目标的灵敏度方面仍存在局限性，并且经常缺乏可靠区分单碱基错配所需的序列特异性。在这种情况下，等温扩增技术（如催化逆转录[13]，[14]，[15]，滚环扩增[16]，[17]和重组酶聚合酶扩增[18]）引起了越来越多的关注。其中，催化逆转录是一种新颖的核酸扩增方法，它结合了聚合酶介导的链延伸和T7 RNA聚合酶驱动的逆转录，能够在恒定温度下实现快速指数级扩增，并显著提高检测灵敏度。等温扩增通常与互补方法结合使用，以进一步提高准确性和灵敏度。一种有前景的策略是CRISPR（规律间隔短回文重复序列）-Cas（CRISPR相关蛋白）系统[19]，[20]，[21]，[22]，[23]。CRISPR-Cas最初被鉴定为细菌免疫机制，现已被重新用作强大的核酸识别工具。其与等温扩增的结合产生了一系列高灵敏度和高效的诊断检测方法。Cas12a是一种II类V型RNA引导的DNA内切酶，通过单个crRNA引导序列识别含有“TTTN”前间隔-相邻基序（PAM）的双链DNA（dsDNA），导致PAM远端的dsDNA发生交错切割，这一过程称为顺式切割[24]，[25]。此外，在目标识别和切割后，Cas12a表现出非特异性的切割活性，降解单链DNA（ssDNA）。这些特性使Cas12a在分子诊断中得到广泛应用。然而，传统的CRISPR/Cas12a检测方法通常仅限于检测dsDNA或ssDNA目标。对于RNA检测，通常需要额外的逆转录步骤和/或DNA预扩增，这可能会引入非特异性扩增并增加假阳性风险。因此，使用Cas12a/crRNA复合物直接检测RNA可以显著减少扩增错误的可能性并提高检测可靠性。
Split crRNA作为一种创新方法在CRISPR-Cas12a框架内出现，提高了分子诊断平台的性能。该方法将CRISPR RNA（crRNA）分为两个部分：一个固定的支架RNA和一个可变的间隔RNA[26]，[27]。最新研究表明，这些部分可以与Cas12a蛋白重新组装，形成具有与天然Cas12a/crRNA复合物相似切割活性的功能性Cas12a/split-crRNA复合物。受Cas12a/split-crRNA复合物独特性质的启发，我们开发了一种基于双环探针的等温扩增策略，结合Cas12a/split-crRNA来准确和灵敏地检测与腹主动脉瘤相关的miRNAs。在这种设计中，目标miRNA与两个双环探针杂交，实现双向链延伸和逆转录，生成丰富的支架RNA。支架RNA随后与Cas12a结合形成Cas12a/支架RNA中间体。同时，相同的靶miRNA作为间隔RNA，引导与Cas12a/支架RNA中间体的组装，生成活性Cas12a/split-crRNA复合物。当被单链DNA触发剂激活后，该复合物会切割荧光团-淬灭剂（FQ）标记的报告基因探针，产生可测量的荧光信号。该方法结合了双重目标识别机制：首先通过催化组装诱导逆转录，其次直接利用目标作为间隔RNA来组装完整的Cas12a/split-crRNA复合物。这种两步识别机制相对于传统的基于Cas12a/crRNA的miRNA检测方法提高了特异性，后者通常仅依赖Cas12a/crRNA来识别miRNA扩增产物。除了高选择性外，该方法还在广泛的动态范围内表现出显著的灵敏度，这是通过结合催化组装诱导的逆转录和split-crRNA引导的Cas12a复合物的切割活性实现的。因此，所提出的技术为miRNA分析提供了一个稳健、选择性和灵敏的平台。
材料和设备
Bst 2.0 DNA聚合酶及其相应的等温扩增缓冲液购自New England Biolabs（美国）。dNTPs和无RNase的水由Takara（大连，中国）提供。LbCas12a（Cpf1）酶和10×反应缓冲液2.1也来自New England Biolabs。本研究中使用的所有核酸，包括SL探针、ssDNA触发剂和FQ探针，均由Sangon Biotech（上海，中国）合成并通过HPLC纯化。它们的序列列在表S1中。
基于Cas12a/split-crRNA的逆转录介导的miRNA检测方法的工作机制
该检测方法使用两种工程化的双茎环DNA探针（SL-1和SL-2），这些探针旨在实现目标催化的组装。如图1所示，目标miRNA与SL-1的“1”结构域杂交，导致SL-1的茎区域展开，从而暴露出“5”片段。释放的“5”片段与SL-2的趾持区域结合，并通过与互补的“5*”区域退火逐渐取代其茎区域，形成SL-1/SL-2杂交体。
结论
总之，我们建立了一种基于荧光的检测策略，将目标诱导的催化组装的高扩增效率与Cas12a/split-crRNA系统的逆转录和切割活性相结合。该方法利用催化组装来启动逆转录，生成丰富的支架RNA。作为split-crRNA的支架RNA与Cas12a结合，形成缺乏切割活性的Cas12a/支架-crRNA中间体复合物。
CRediT作者贡献声明
沙·杰汉（Shah Jehan）：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、概念化。
徐一燕（Yiyan Xu）：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。
王莹（Ying Wang）：研究、正式分析。
杨博涵（Bohan Yang）：资源、正式分析、数据管理。
孙和成（Hecheng Sun）：软件、资源。
韩松（Song Han）：方法学、正式分析、数据管理。
彭超（Chao Peng）：软件、研究、数据管理。
吴振（Zhen Wu）：软件、研究。
张鹏（Peng Zhang）：软件、资源。
王海阳（Haiyang Wang）：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。
