基于DNA酶-适配体开关和环介导等温扩增技术的工程化适配体传感器，用于超灵敏污染物检测

《Microchemical Journal》：Engineering aptasensor based on DNAzyme-aptamer switch and loop-mediated isothermal amplification for ultrasensitive contaminant detection

双通道电化学aptasensor通过DNA四面体（DT）调控构象，DNAzyme介导电信号转换，结合环介导等温扩增（LAMP）实现痕量检测，对BPA、Malachite green和Trichlorfon的检测限分别为10 fM、2.7 pM和36.9 pM，提供高灵敏度、便携式食品污染物检测新方法。

　　

陈赞霖|李海明|陈燕|韩双燕

华南理工大学生物与生物工程学院发酵与酶工程广东省重点实验室，广州510006，中国

摘要

背景

食品中的小分子污染物与200多种疾病有关，对公共卫生构成重大威胁。传统的检测技术（如高效液相色谱法HPLC）耗时、劳动强度高，且需要设备齐全的实验室环境，因此不适合快速、高通量的现场筛查。因此，开发灵敏、高效且可现场应用的检测方法仍是食品安全监测中持续存在的关键挑战。

结果

本文开发了一种适配体传感器，利用DNA四面体（DT）支架、DNA酶-适配体开关和环介导等温扩增（LAMP）技术，实现对小分子污染物的灵敏定量检测。四面体支架使DNA酶-适配体复合物以最佳构象定位，从而提高适配体的构象灵活性，实现快速目标捕获。关键在于，目标结合会诱导DNA酶的别构激活，触发Mg²⁺依赖的自切割反应，通过可控的铁氰化物（Fc）标签和亚甲蓝（MB）释放，将生物识别事件转化为可测量的电化学信号。该适配体传感器在8.8 pM至109.5 nM范围内对双酚A的检测具有优异的线性，检测限（LOD）为8.0 pM；对于孔雀石绿和三氯芬的检测，LOD分别为2.7 pM和36.9 pM。同时，被DNA酶切割的短DNA片段被用作LAMP的内置引物。LAMP反应后，双酚A的LOD确定为10.0 fM。

意义

这种传感器是首个集成LAMP与DNA酶和四面体纳米结构的双通道适配体传感器。它操作简单，对双酚A的检测限低至10 fM，并通过可互换的适配体序列实现多种污染物的检测，显示出强大的多功能性和广泛的应用性。

引言

食品污染物（如农药、重金属离子、毒素、病原菌等）可能出现在从生产到消费的任何阶段[8]。世界卫生组织报告称，这些污染物可能导致200多种疾病，对人类健康构成重大风险[14]。因此，建立有效的可靠技术来检测和识别食品中的各种污染物至关重要。目前，食品污染物的分析技术主要包括高效液相色谱法（HPLC）[13]、原子吸收光谱法[3]、表面等离子体共振[10]和表面增强拉曼散射[23]。虽然这些方法可以提供令人满意的污染物定性和定量分析，但它们通常耗时、成本高昂，不适合大规模样本的快速现场筛查[2]。因此，迫切需要开发在非实验室条件下快速检测食品污染物的简单方法。

适配体是单链寡核苷酸探针，可以是DNA或RNA，通常由10到100个碱基组成，可通过SELEX指数富集方法获得[19]。已经开发了许多用于检测食品污染物的适配体传感器，包括黄曲霉毒素B1[16]、恩诺沙星[22]、卡那霉素[25]和百草枯[7]。电化学适配体传感器（E-Aptasensor）是一种特殊类型，可将适配体构象变化引起的生物信号转换为可测量的电信号，具有高灵敏度、快速响应时间和低成本等优点[5]。其中，方波伏安法（SWV）是一种大振幅差技术，与常用的差分脉冲伏安法（DPV）相比，具有更高的灵敏度、更低的检测背景和更快的扫描速度，更适合即时检测（POCT）[20]。

对于E-Aptasensor，适配体在传感界面上的固定和空间分布对其传感性能有显著影响。然而，单链DNA（ssDNA）适配体常常在传感器表面聚集形成大簇，导致检测效率降低[21]。作为一种高度稳定的金字塔状结构，DT以其优异的生物相容性、稳定性和可修饰性而闻名[17]。其坚固的三维结构防止了像ssDNA那样的密集聚集，从而避免了由于静电效应和空间阻碍导致的目标与结合位点之间的相互作用[18]。Ma及其同事提出将HER2靶向的DNA适配体改造成DNA四面体（HApt-DT）作为药物递送系统，证明使用DT可以显著提高药物装载能力[9]。在另一项工作中，Ye引入了一种基于DT的双块适配体固定策略来构建E-Aptasensor，其中DT支架为双块适配体的目标识别提供了足够的侧向空间[28]。

尽管已经开发了许多基于DT或DNA酶的传感器，但在处理极低浓度污染物时，它们的检测灵敏度仍面临挑战。随着生物技术的进步，等温扩增技术逐渐应用于生物传感器，提高了其检测灵敏度。常见的等温扩增技术包括滚环扩增（RCA）[1]、链置换聚合酶扩增（SDA）[4]和转录介导的扩增（TMA）[24]。尽管这些技术被广泛使用，但它们并不完美，例如TMA需要三个不同的酶促步骤，且起始材料仅限于单链核酸。SDA和RCA都需要初始的热变性步骤，这与等温扩增的初衷不完全一致。LAMP是一种酶促扩增技术，利用引物针对特定区域并在DNA聚合酶存在下触发扩增[11]，具有快速扩增和低成本的优势。然而，其引物的复杂设计限制了其应用。在我们的研究中，引物是通用的，只需根据不同的适配体更换引物M，避免了这种复杂设计。为了提高检测的特异性和灵敏度，研究人员采用了DNA酶作为触发开关[15]。金属离子依赖的DNA酶是能够在金属离子辅助下切割特定RNA序列的催化DNA分子，易于合成、稳定且成本效益高。例如，Zhang等人[30]使用镁离子依赖的DNA酶切割特定核酸链，释放出与荧光素基有机染料结合的多个自由序列，显著增强了荧光发射并提高了检测灵敏度。

本文基于DT、别构DNA酶-适配体开关和LAMP开发了一种E-Aptasensor，用于超灵敏地定量检测双酚A、孔雀石绿和三氯芬。DT提供了稳定有序的固定界面，为后续级联反应奠定了低背景和高重复性的基础。DNA酶-适配体开关实现初始信号转导和催化扩增，而LAMP利用切割的DNA片段作为引物进行指数级扩增，将微弱的化学信号转化为大量易于检测的核酸产物。如图1所示，适配体传感器通过将DNA酶链修饰到DT的一个边缘构建而成，三个巯基化的顶点将纳米结构牢固地固定在金电极上。刚性的、空间定义明确的DT支架在防止适配体缠结、促进识别元素的一致定向以及增强目标结合动力学方面起着关键作用——这些特性有助于提高重复性和信号稳定性，优于非结构化或溶液相系统。目标结合后，固定的DNA酶被激活并切割Fc-DNA底物，释放的Fc导致电化学信号下降，其幅度与目标浓度相关。重要的是，切割的DNA片段随后作为LAMP的启动剂，实现指数级扩增，显著提高了灵敏度至fM级别。这种级联设计——结合了DT的空间控制、DNA酶的催化信号转导和LAMP的强大扩增作用——共同解释了我们的平台相对于许多现有基于DT的传感器实现了更低的LOD。尽管LAMP的加入延长了总检测时间，但获得的超高灵敏度和LAMP与便携式等温设备的兼容性支持了这种集成策略在现场、痕量污染物筛查中的潜力。

材料

双酚A（BPA，98%，CAS: 80-05-7）、双酚B（BPB，98%，CAS: 77-40-7）、双酚F（BPF，98%，CAS: 609-92-8）、双酚S（BPS，99.9%，CAS: 80-09-1）、双酚Z（BPZ，98%，CAS: 843-55-0）、双酚AF（BPAF，97%，CAS: 1478-61-1）、孔雀石绿草酸盐（MG，98%，CAS:2437-29-8）、白孔雀石绿（LMG，99.8%，CAS:12-73-7）、呋喃酮（FT，99.3%，CAS:139-91-3）、环丙沙星（CPFX，98%，CAS:85721-33-1）、氯霉素（CM，99.9%，CAS:56-75-7）、三氯芬（TRI，98.8%，CAS:52-68-6）

污染物检测原理

在本研究中，LOD使用3σ规则计算，其中σ是十次空白测量的标准差，S是校准曲线的斜率。所有重复性实验均重复三次以确保数据准确性。图1展示了SWV适配体的组装策略及其污染物检测机制。DT支架通过自组装构建，并通过Au-S键固定在电极上。Fc和MB作为信号增强剂

加标样品的评估

双酚A常用于制造塑料瓶（包括矿泉水瓶）、医疗设备和食品包装。因此，我们选择了自来水、瓶装矿泉水和果汁作为加标双酚A的基质。由于MG是一种在水产品中频繁检测到的禁用水产添加剂，我们在自来水中、鱼肌肉和虾组织中通过加标标准物质来分析MG，以模拟水生生态系统中的污染情景。

结论

总之，我们开发了一种多功能的电化学传感平台，用于检测食品污染物。其核心意义在于满足两个关键的实际需求：快速、现场筛查和高度灵敏的痕量定量。对于常规监测，该平台采用一步组装的四面体支架，为适配体提供优化的定向和结合空间，显著提高了目标识别能力。

CRediT作者贡献声明

陈赞霖：撰写——原始草案、方法学、数据分析、概念化。李海明：验证、调查、数据管理。陈燕：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、项目管理、调查。韩双燕：撰写——审阅与编辑、资源管理、调查、资金获取、数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFA0913603）的资助。