《Microchemical Journal》：Nuclear morphodynamics-driven deep learning framework for high-precision single circulating tumor cell viability quantification
编辑推荐：
传统CTC存活率评估方法存在灵敏度低、群体平均分析、细胞毒性干扰等问题。本研究通过整合YOLOv8框架与多模态架构，开发了基于核形态动态分析的深度学习系统，创新性地采用膜连续性指数和染色质空间分布模式作为定量生物标志物，实现了非侵入性、高精度的单细胞CTC存活率实时监测，突破传统依赖细胞毒性试剂的局限，为转移风险分层和个体化治疗监测提供新范式。
曾洪天|杨一瑶|谭浩|王兆亮|郝婷婷|张青青|郭志勇
中国浙江省宁波市宁波大学材料科学与化学工程学院农产品质量与安全国家重点实验室，315211
摘要
传统的循环肿瘤细胞（CTC）活力评估方法在临床应用中面临诸多挑战，包括检测灵敏度不足、采用群体平均分析方法以及细胞毒性干扰等问题。为了解决这些问题，我们开发了一种基于深度学习的单细胞核形态测量分析系统，该系统结合了YOLOv8框架和多模态架构，以实现精确的CTC活力量化。我们使用多柔比星处理的HeLa细胞建立了一个药理学诱导的核形态动态模型，以模拟染色质结构重组过程。优化的分析流程将YOLOv8x识别模块与YOLOv8x-cls分类引擎相结合，形成了一个以可量化的核生物标志物（膜连续性指数和染色质空间分布模式）为基础的自动化活力评分系统。验证研究表明，该平台能够实现全血样本中CTC的实时定位和单细胞活力评估。这种无标记、高内容的分析方法为转移概率分层和患者特异性治疗反应监测提供了变革性的技术框架，克服了传统依赖细胞毒性方法的根本局限。
引言
循环肿瘤细胞（CTC）是指从原发性实体肿瘤脱落进入外周循环的恶性细胞，它们通过逃避免疫监视能力表现出转移潜能，显著增加了癌症患者的临床风险[1]、[2]、[3]。尽管现代肿瘤学诊断技术取得了显著进展，但转移性恶性肿瘤的五年生存率仍低于30%，这凸显了现有CTC检测方法的局限性[4]、[5]。现有平台面临三个主要挑战：（1）外周血中CTC极为罕见（1–10个细胞/毫升），需要超高的分析灵敏度[6]；（2）肿瘤异质性导致的表面生物标志物表达模式动态变化[7]；（3）传统活力检测方法（如CCK-8 [8]、ATP生物发光 [9]、MTT比色法 [10]）由于依赖群体平均信号而无法解析单细胞代谢活动[11]、[12]、[13]。虽然新兴技术如荧光标记可以实现单细胞分析，但光毒性可能干扰细胞生理[14]，微流控方法也容易受到血液基质的干扰[15]。这些限制促使我们开发出具有单细胞分辨率的非侵入性实时监测平台，以准确评估CTC活力。
为了解决对单细胞分析方法的迫切需求，我们团队之前建立了一种基于全细胞形态的无标记、无毒且准确的深度学习模型来评估单个肿瘤细胞的活力[16]。然而，考虑到全细胞形态可能受到环境因素的影响，我们开始寻找更稳定的细胞活力指标——细胞核。细胞核作为真核细胞的遗传调控中心，其形态动态特征与细胞活力状态高度相关[17]、[18]、[19]。研究表明，在肿瘤细胞早期凋亡或坏死过程中，细胞核会出现可量化的形态变化，包括染色质边缘化和核膜内陷指数增加[20]。与易受机械应力和环境干扰影响的全细胞形态参数相比，核形态测量方法具有更好的生物稳定性和病理特异性[21]、[22]，使其成为单细胞活力评估的理想生物标志物[23]、[24]。然而，传统的显微成像技术在动态捕捉微米级核形态变化方面存在局限性[25]、[26]，手动解读效率和识别准确性无法满足临床诊断要求[27]。鉴于这些限制，本研究整合了深度学习技术，以实现高精度的核形态动态检测和分析。
深度学习作为推动生成式人工智能发展的关键技术之一，通过多层神经网络从数据中分层提取特征[28]，模拟人类认知过程，自主学习来自多模态信息（文本、图像、音频等）的复杂模式和高层次表示，从而具备理解和生成能力[29]、[30]、[31]。与传统机器学习方法相比，深度学习在自动特征提取、高度非线性建模能力和强大的表达能力方面具有明显优势，能够在无需人工干预的情况下从海量数据集中进行模式识别和知识转移[32]、[33]、[34]。目前，深度学习已在医学图像分析[35]、临床诊断[36]、生物制药开发[37]和蛋白质合成[38]等多个领域取得突破性进展。随着生物技术和医疗实践的快速发展，积累了大量的生物医学数据，包括医学图像、脑电图、基因组学、蛋白质序列等异构信息[39]、[40]。利用深度学习的技术优势，可以系统处理大量异构数据，自动提取复杂医学图像数据中的多级特征和潜在语义信息，建立非线性学习模型以解析复杂关系并整合新兴知识[41]，最终实现精确的多目标分割、对象检测、自动化数据分类和预测性结果输出[42]、[43]、[44]、[45]、[46]。
本研究通过将核形态动态分析与深度学习算法相结合，建立了一个单细胞CTC活力评估框架（图1）。该方法消除了传统检测技术中的光毒性和基质干扰，实现了对细胞生理状态的实时非侵入性成像。这一方法为研究肿瘤转移机制和制定个性化治疗策略提供了新的技术途径。
实验部分
使用CellTiter-Lumi?荧光试剂校准细胞活力
实验步骤如下：（1）将贴壁细胞用胰蛋白酶处理成单细胞悬浮液，计数后以每孔1000个细胞的密度接种到不透明的96孔板中，每孔加入100微升悬浮液。（2）将板子在37°C和5%二氧化碳条件下培养4小时以促进细胞粘附。（3）去除培养基后，向每个孔中加入含有0.10微摩尔/升多柔比星的100微升PBS。然后在37°C和5%二氧化碳条件下培养指定时间：0.5小时、1小时、2小时、2.5小时……
基于核形态的活力评估可行性分析
使用CellTiter-Lumi?试剂检测多柔比星暴露时间与HeLa细胞活力之间的相关性，发现细胞活力随时间呈现五种不同的状态，这些状态由细胞核形态的渐进性变化定义。定量分析显示活力随时间下降：100%（状态I，0小时），75%（状态II，1小时），50%（状态III，2.5小时），25%（状态IV，4.5小时），0%（状态V，10.5小时）（图1A）。细胞核形态显示出特定状态的退化特征：
结论
总之，本研究成功地将核形态动态分析与基于YOLOv8的深度学习框架相结合，实现了CTC的高精度单细胞活力评估。所建立的平台有效解决了传统方法的局限性，包括灵敏度不足、缺乏单细胞分辨率和细胞毒性干扰等问题，提供了一种无标记、非侵入性和实时的分析解决方案。
CRediT作者贡献声明
曾洪天：撰写初稿，数据整理。杨一瑶：验证，监督。谭浩：研究，形式分析。王兆亮：撰写、审稿与编辑，方法学设计。郝婷婷：项目管理，方法学设计。张青青：资金获取，概念构思。郭志勇：撰写、审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（82273681）、浙江省自然科学基金（LQN26B050007）和宁波市自然科学基金（2024J476）的财政支持。
