《Molecular & Cellular Proteomics》：Characterization of Usher Syndrome Type 2-Associated Proteins in the Retina via Affinity Purification-Mass Spectrometry
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本研究针对Usher综合征2型(USH2)致病机制不清的难题，采用多种亲和纯化结合质谱技术，系统性鉴定了视网膜中usherin、ADGRV1和whirlin的相互作用蛋白。研究发现USH2复合物通过细胞外结构域与胶原纤维、弹性纤维形成相关蛋白相互作用，并参与TGFβ信号通路；细胞内区域则与Gαi/Gαq蛋白偶联，调控细胞粘附和纤毛功能。该研究首次揭示了USH2复合物连接细胞外基质与细胞内肌动蛋白网络的核心功能，为理解USH2相关视网膜变性机制提供了新视角。
在我们身体的感觉系统中，视网膜和耳蜗扮演着至关重要的角色。然而，当Usher综合征（Usher syndrome）发生时，这两种感官会同时受损，导致患者既失明又失聪。其中，2型Usher综合征（USH2）是最常见的临床类型，约占所有Usher综合征病例的70%。这种疾病主要由USH2A、ADGRV1和WHRN这三个基因的突变引起，它们分别编码usherin、ADGRV1和whirlin蛋白。这些蛋白在视网膜光感受器细胞的纤毛周围膜复合体（periciliary membrane complex）和内耳毛细胞的踝连复合体（ankle link complex）中形成多蛋白复合物。尽管科学家们已经知道这些蛋白的缺失会导致视网膜变性和听力损失，但关于这个蛋白复合物的具体分子功能和致病机制，我们仍知之甚少。目前，对于由这三个USH2基因突变引起的疾病，还没有有效的治疗方法。
为了解决这一难题，由Jun Yang领导的研究团队在《Molecular》杂志上发表了一项重要研究。他们利用先进的生物化学和蛋白质组学技术，深入探究了USH2蛋白在视网膜中的相互作用网络，旨在揭示USH2复合物的功能及其导致视网膜变性的分子机制。
研究人员采用了多种关键技术方法来解析USH2蛋白的相互作用组。他们分别从牛和小鼠的视网膜组织中提取蛋白进行实验。核心技术包括：多种亲和纯化方法（使用特异性抗体针对内源性USH2蛋白进行免疫共沉淀，以及使用带有标签（如Fc标签、Flag标签、GST标签）的USH2蛋白片段（即"诱饵"蛋白）进行下拉实验）与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）联用，以系统性地鉴定与USH2蛋白相互作用的蛋白。随后，他们通过免疫印迹（Western blot）、免疫荧光染色和共定位分析等方法在细胞系（如HEK293、COS-7细胞）和小鼠视网膜组织中对筛选出的高置信度相互作用蛋白进行了正交验证。此外，研究还运用了生物信息学工具（如GO和Reactome通路富集分析、STRING相互作用网络分析）对鉴定出的相互作用蛋白进行功能注释和通路分析。
识别细胞内ADGRV1相互作用蛋白
研究人员首先关注了ADGRV1的细胞内C末端区域。他们使用GST标记的ADGRV1 C末端片段作为诱饵，从牛视网膜裂解液中下拉相互作用蛋白。质谱分析鉴定出135个潜在的ADGRV1细胞内结合伴侣。功能富集分析显示，这些蛋白与肌动蛋白细胞骨架、分子伴侣复合物（CCT复合物）、Bardet-Biedl综合征复合物（BBSome）以及纤毛相关过程密切相关。这表明ADGRV1的细胞内部分可能参与细胞结构维持、蛋白质折叠和细胞内运输等关键生物学过程。
鉴定细胞外ADGRV1相互作用蛋白
由于ADGRV1的绝大部分位于细胞外，研究团队设计了覆盖其不同细胞外结构域（如Calxβ重复序列、LG结构域、EAR/EPTP重复序列和GAIN结构域）的多个蛋白片段作为诱饵进行下拉实验。从牛视网膜中鉴定出120个细胞外和质膜蛋白。通路分析表明，这些蛋白显著富集于细胞外基质（ECM）组织、肽酶活性调节、胶原生物合成与修饰、弹性纤维形成以及TGFβ信号通路等。特别值得注意的是，ADGRV1的V2片段（包含EAR/EPTP重复序列）特异性结合了TGFβ信号通路相关蛋白（如TGFB1, TGFB2, LTBP1, LTBP4），提示ADGRV1可能通过此区域参与调控TGFβ信号。
识别细胞外usherin相互作用蛋白
针对usherin，研究人员聚焦于其含有致病性错义突变的热点区域，构建了相应的细胞外片段诱饵（如LGLNLE、LNLE、F17-21、F19-21）。实验鉴定出47个潜在的usherin细胞外相互作用蛋白。功能分析揭示，usherin参与ECM组织、对机械刺激的反应、细胞-底物粘附、胶原代谢过程等。特别发现usherin的FN3结构域区域能与ADGRV1直接结合，并且usherin的不同细胞外区域之间也能发生自身相互作用。
通过免疫共沉淀和质谱鉴定ADGRV1、usherin和whirlin的相互作用蛋白
为了在更接近生理条件的背景下验证相互作用，研究团队使用针对ADGRV1、usherin和whirlin的特异性抗体，从小鼠和牛视网膜裂解液中免疫共沉淀内源性的USH2蛋白复合物。通过严格的统计学分析（单因素方差分析ANOVA和Tukey's HSD事后检验），他们分别鉴定出124个、26个和7个高置信度的与ADGRV1、usherin和whirlin相互作用的蛋白。其中，一些与遗传性视网膜疾病相关的蛋白，如BBS8、KIAA1549和TUB，也被发现与USH2蛋白存在相互作用，暗示USH2的病理机制可能与其他已知的视网膜色素变性（RP）疾病通路存在交叉对话。更重要的是，内源性的Gαi3 (GNAI3) 和 Gα11 (GNA11) 蛋白被鉴定为ADGRV1的相互作用蛋白，提示ADGRV1在视网膜中可能主要通过Gαi和Gαq通路转导信号。
usherin细胞外自身相互作用及与ECM蛋白的相互作用
验证实验证实，usherin的N末端和C末端细胞外区域能够相互结合，这种自身相互作用可能调节usherin与其他蛋白的互作。此外，研究证实了usherin与EPHA3（Ephrin受体A3）和MMP19（基质金属蛋白酶19）的直接相互作用，并在共转染的细胞中观察到了良好的共定位。
ADGRV1与usherin及EMILIN3的相互作用
研究证实了ADGRV1和usherin细胞外区域之间存在直接相互作用，并且这种相互作用是由usherin的FN3结构域和ADGRV1的Calxβ基序介导的。同时，研究还发现EMILIN3（弹性蛋白微纤维界面蛋白3）与ADGRV1存在相互作用，并在小鼠和人类光感受器细胞的纤毛周围区域与ADGRV1和usherin共定位。EMILIN3已知能结合TGFβ前体蛋白并抑制TGFβ信号，这进一步支持了ADGRV1可能参与调控光感受器细胞纤毛周围ECM中的TGFβ信号。
小鼠光感受器中高置信度相互作用蛋白的验证与定位
研究人员利用免疫荧光染色和共免疫沉淀等方法，对另外几个高置信度的相互作用蛋白进行了验证。例如，胶原VI（COL6A1）与ADGRV1在光感受器的纤毛周围区域共定位。SIPA1信号在基体/中心粒位置呈双点状分布，邻近ADGRV1信号，并且能被usherin抗体共沉淀。PTPN23分布在光感受器内段，其信号与ADGRV1信号紧密相邻。这些结果进一步支持了这些蛋白与USH2复合物在视网膜中存在功能性相互作用。
本研究通过系统性的蛋白质相互作用组学分析，极大地扩展了我们对USH2蛋白复合物功能的认识。研究结果表明，USH2复合物并非一个简单的结构支架，而是一个多功能的信号枢纽。其主要结论和意义包括：
- 1.
连接ECM与细胞骨架：USH2复合物通过其细胞外部分与ECM成分（如胶原、弹性纤维相关蛋白）相互作用，并通过细胞内部分与肌动蛋白细胞骨架和信号蛋白（如Gα蛋白）相连，从而在ECM和细胞内网络之间建立起机械信号和化学信号的桥梁。
- 2.
参与ECM动态重塑：USH2蛋白与多种参与胶原生物合成、修饰和降解的酶（如PLODs, MMP19）相互作用，表明该复合物积极参与光感受器周围ECM的稳态维持和重塑。
- 3.
调控关键信号通路：研究发现ADGRV1与Gαi和Gαq蛋白相互作用，并提示其可能参与TGFβ信号通路和mTOR/PI3K信号通路。这些通路在细胞生长、分化和存活中至关重要，其失调可能与光感受器变性有关。
- 4.
揭示新的疾病关联：鉴定出与其他视网膜疾病相关的蛋白（如BBS8, TUB）与USH2蛋白相互作用，提示不同的视网膜变性疾病之间可能存在共同的分子路径或交叉对话。
- 5.
为治疗提供新靶点：该研究绘制了迄今为止最全面的视网膜USH2蛋白相互作用网络，揭示了USH2复合物参与的多条潜在信号通路，为未来开发针对Usher综合征2型及相关视网膜变性的治疗策略（如靶向特定的蛋白相互作用或信号通路）提供了重要的理论依据和新的分子靶点。
总之，这项研究自从近二十年前USH2复合物被发现以来，首次深入揭示了其在光感受器中的复杂功能网络，将USH2蛋白的功能从主要的结构作用扩展到了机械传感、ECM重塑和信号转导等多个关键生物学过程，极大地推动了我们对USH2相关疾病机制的理解。
