《Journal of Neurochemistry》：Bidirectional Communication Between Astrocytes and Neurons via Extracellular Vesicles: A Multi-Omics Approach
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本文通过蛋白质组学（LC-MS/MS）与转录组学（RNA-seq）多组学整合策略，系统解析了星形胶质细胞与神经元通过细胞外囊泡（EVs）介导的双向信号传递机制。研究发现，AEVs（星形胶质细胞来源EVs）可促进神经元分化与突触成熟，而NEVs（神经元来源EVs）则诱导星形胶质细胞增殖与糖酵解代谢重编程。共培养模型（COEVs）进一步揭示细胞相互作用动态调控EVs cargo中能量代谢（如糖原磷酸化酶Pygb）、钙稳态（ATP2B2）及神经发育相关蛋白（如NCAM1）的分泌，凸显EVs在脑内稳态维持与神经疾病中的潜在靶点价值。
1 引言
脑内星形胶质细胞与神经元的相互作用是维持神经功能与稳态的核心。除经典的物理接触与旁分泌信号外，细胞外囊泡（EVs）作为携带核酸、脂质与蛋白质的膜性结构，日益被视为细胞间通讯的关键媒介。研究表明，EVs cargo可反映细胞生理或病理状态，在神经退行性疾病中具备生物标志物潜力。然而，单培养模型难以模拟体内复杂的细胞互作网络，且EVs对靶细胞转录组的调控机制尚不清晰。本研究通过整合蛋白质组学（LC-MS/MS）与转录组学（RNA-seq），旨在揭示星形胶质细胞与神经元通过EVs介导的双向调控网络，及其在发育、代谢与突触可塑性中的动态作用。
2 材料与方法
2.1 细胞培养与处理
研究使用新生BALB/c小鼠海马组织分离星形胶质细胞与神经元。星形胶质细胞采用DMEM培养基（含10% FBS）培养，实验前更换为无血清的Neurobasal A培养基以排除血清EVs干扰。神经元培养14天至突触成熟，并通过Ara-C处理获得纯化单培养。共培养模型（COEVs）通过将星形胶质细胞接种至14日龄神经元培养体系中共培养48小时建立。
2.2 细胞外囊泡分离与表征
通过差速离心法从条件培养基中分离AEVs、NEVs与COEVs。透射电镜（TEM）确认EVs形态完整（直径15-280 nm），且无蛋白聚集体污染。蛋白质组学分析采用MED-FASP法进行酶切，LC-MS/MS检测肽段，MaxQuant软件定量，以总蛋白法（TPA）计算浓度。
2.3 转录组学分析
从对照组（A：星形胶质细胞单培养；N：神经元单培养）与实验组（AN：星形胶质细胞+NEVs；NA：神经元+AEVs）中提取RNA，建库后使用Illumina NextSeq 500测序。数据经FastQC质控、HISAT2比对至小鼠基因组（GRCm39），DESeq2进行差异表达基因（DEGs）分析（筛选标准：padj <0.05，log2FC >1）。功能富集通过GSEA与clusterProfiler完成。
3 结果
3.1 EVs表征与其蛋白质组特征
TEM显示分离的EVs具有典型脂质双层结构（图1a）。蛋白质组学共鉴定679种蛋白质，其中300种含唯一肽段。AEVs、NEVs与COEVs分别包含133、259和270种蛋白质，其中11种（如CD9、Tnc）、14种（如GSK3β、FUS）及23种（如Ugp2、Atp2b2）为各自特有（图1c）。COEVs中独特蛋白涉及糖原代谢（Ugp2、Pygb）、神经递质合成（Asrgl1）及钙稳态调控（Atp2b2）。功能富集显示，AEVs与NEVs均富集于应激响应、系统发育及能量代谢通路（如糖酵解、TCA循环）（图2a-d）。
3.2 共培养调控EVs蛋白质组成
与单培养相比，COEVs中发育相关蛋白（如促进神经突生长的App、Gpm6a）浓度升高，而迁移相关蛋白（Dpysl2、Flna）降低（图3a）。突触传递相关蛋白（如Vamp2、Got1）分泌减少，而神经递质清除蛋白（Glud1、Slc1a3）增加（图3b）。应激响应蛋白（Clic1、Park7）与能量代谢酶（如Slc2a1、Gapdh）亦发生动态调整，提示细胞互作重塑EVs cargo以适应生理需求。
3.3 EVs处理的细胞转录组谱
RNA-seq揭示NEVs诱导星形胶质细胞92个DEGs（60个上调，32个下调），而AEVs调控神经元186个DEGs（128个上调，58个下调）（图4b-c）。PCA分析显示星形胶质细胞与神经元转录组显著分离（图4e），且仅Nemf基因在两类细胞中共同下调，表明EVs作用具有细胞特异性。
3.4 EVs调控发育相关基因表达
在神经元中，AEVs上调神经前体细胞分化（Rbms1、Phf21b）、突触形成（Ptprm）及迁移（Tor1a）相关基因，而下调增殖调控因子Plag1（图5a）。AEVs富含神经突生长（Gpm6b、Tnc）与分化（Clu）相关蛋白（图5b）。在星形胶质细胞中，NEVs促进纺锤体形成（Cep192）、增殖（Trnp1、Id4）与迁移（Tnc）基因表达（图5c），流式细胞术进一步证实NEVs增加Ki-67阳性细胞比例与G2/M期占比（图S5）。NEVs cargo中富含细胞周期（Ctnnb1、Mapk1）与骨架重组（Capza2）蛋白（图5d）。
3.5 突触传递相关基因响应
AEVs调控神经元中突触成熟（Hdac1下调）及可塑性相关基因（Phf21b、Nfkb2）。星形胶质细胞对NEVs的响应集中于发育相关基因，仅Gpr37（调控NMDAR活化）与突触功能直接相关。表明AEVs可能通过促进突触成熟间接影响神经传递。
3.6 细胞应激响应基因变化
尽管既往研究显示NEVs改变星形胶质细胞钙稳态但未影响ROS水平，本研究发现AEVs上调神经元中氧化应激防御（Pon1、Nfkb2）及凋亡调控基因（Sgpl1），而NEVs诱导星形胶质细胞自噬（Atg4d）与DNA修复（Pwwp3a）基因表达（图6a,c）。EVs cargo中包含凋亡（Clu、Ywhab）、氧化应激（Gstp1、Prdx1）及热休克蛋白（Hspd1），提示EVs可能通过蛋白递送辅助应激适应（图6b,d）。
3.7 能量代谢基因调控
AEVs处理神经元后，糖代谢（Pdk4）、氧化磷酸化（Mt-Atp8）及脂稳态（Sgpl1）基因表达改变（图7a），且AEVs富含糖酵解（Eno1、Tpi1）与线粒体蛋白（Atp5a1）。星形胶质细胞中NEVs下调TCA循环关键酶Dlst，可能推动其向糖酵解代谢转变，支持“星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭”假说。
4 讨论
本研究证实EVs介导的星形胶质细胞-神经元通讯具有双向性与细胞特异性。共培养模型揭示细胞接触动态调整EVs cargo，如钙调控蛋白（Atp2b2）与能量相关酶（Ugp2）的分泌，以协同应对突触活动与能量需求。转录组数据进一步表明，NEVs驱动星形胶质细胞增殖与代谢重编程，而AEVs促进神经元分化与突触成熟。这些发现为神经发育疾病（如自闭症、癫痫）及退行性病变（如ALS）提供了潜在干预靶点。
5 总结
EVs作为星形胶质细胞与神经元通讯的载体，通过蛋白质与核酸 cargo 精确调控靶细胞转录组，影响发育、代谢与突触可塑性。多组学整合策略揭示了细胞互作在生理与病理条件下的动态调节网络，为神经科学领域提供了新的研究视角。
6 研究局限性
共培养EVs的蛋白质组分析因样本合并无法进行差异比较，且无法区分星形胶质细胞与神经元来源的蛋白。未来需通过细胞特异性标记或单细胞技术进一步解析EVs异质性。
