《Plant Direct》：Targeting dCas9-SunTag to a Susceptibility Gene Promoter Is Sufficient for CRISPR Interference
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本研究创新性地利用dCas9-SunTag系统靶向木薯易感基因nCBP-1/nCBP-2启动子，首次发现无需融合转录抑制结构域即可通过CRISPR干扰（CRISPRi）实现基因表达抑制。该研究为植物抗病毒育种提供了新思路，表明单纯dCas9结合启动子区域即可有效阻断病原体与宿主因子的互作。
引言
木薯作为全球8亿人口的主粮作物，其生产深受木薯褐条病（CBSD）等病害威胁。该病由马铃薯Y病毒科（Potyviridae）的两种ipomovirus属病毒引起，需借助宿主真核翻译起始因子4E（eIF4E）家族蛋白完成侵染。前期研究发现，同时敲除两个eIF4E家族基因nCBP-1和nCBP-2可降低木薯对CBSD的易感性，但完全敲除eIF4E家族基因会影响正常生理功能，故需探索基因敲降（knockdown）策略。
研究设计
团队构建了包含三组分的表观基因组编辑系统：①失活Cas9与SunTag表位融合蛋白（dCas9-SunTag）；②烟草DRM甲基转移酶催化结构域与SunTag抗体片段融合蛋白（scFvSunTag-DRMcd）；③聚合酶II启动子驱动的tRNA-gRNA阵列。通过设计靶向nCBP-1和nCBP-2启动子的gRNA，在木薯栽培种TME419中获得6个转基因株系，包括缺失DRMcd的CRISPRi对照（ΔDRMcd）和缺失gRNA的脱靶对照（ΔgRNA）。
甲基化编辑效果
扩增子亚硫酸氢盐测序（ampBS-seq）显示，野生型木薯nCBP启动子区域无甲基化，而实验株系#40和#80在CHH和CHG序列背景下出现特异性de novo甲基化，最高甲基化水平达70%。对照实验表明，DRMcd靶向性取决于gRNA介导的dCas9定位，非特异性甲基化水平显著较低。
基因表达调控机制
qRT-PCR分析发现nCBP-1在本氏烟草中表达量极低（周期定量值Cq>30），故聚焦nCBP-2表达分析。实验株系#40/#80中nCBP-2表达显著下降，但ΔDRMcd对照株系（#179/#188）同样出现表达抑制，证实dCas9-SunTag结合启动子区域即可通过空间位阻效应实现CRISPR干扰，无需DRMcd参与。进一步在MeSWEET10a启动子实验中，靶向TAL20效应因子结合元件的dCas9-SunTag使病原菌诱导的基因表达下降10倍，但未能完全抑制水浸状症状。
讨论与应用前景
本研究首次在稳定转基因植物中证实dCas9-SunTag系统具有独立于甲基化编辑的CRISPRi功能。虽然靶向甲基化成功建立，但缺乏CG序列甲基化可能影响表观遗传的稳定性。相比传统CRISPR敲除，CRISPRi技术可实现对多基因家族成员的精准敲降，避免完全敲除导致的致死效应。未来需通过遗传分离验证甲基化遗传性，并探索该技术对CBSD抗性的实际效果。
实验方法
转基因木薯通过农杆菌介导法获得，甲基化分析采用ampBS-seq技术，基因表达通过SYBR Green qPCR检测，以内参基因PP2A和GTPb标准化。gRNA通过CRISPOR设计，载体构建采用pDIRECT_21C系统。
