《Phytomedicine》：Single-cell transcriptomics reveals the toxic mechanism and therapeutic target of ubiquitously distributed mycotoxin deoxynivalenol
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DON诱导的睾丸毒性单细胞机制研究及其KDM5A调控治疗策略。
吴文峰|张丹丹|冯慧|赵晨|何洁红|唐鹏兆|周耀川|吴金璐|常德贵|于旭军|刘娟|彭成
四川省中医药种质资源创新与高效利用重点实验室，成都中医药大学药学院，中国成都611137
摘要
背景
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是一种普遍存在于草药和日常饮食中的霉菌毒素，对男性生殖健康构成重大威胁，但目前尚缺乏对其在单细胞水平上的睾丸毒性的研究。
目的
本研究结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和功能分析，以揭示DON诱导的睾丸毒性的细胞和分子机制。
方法
通过形态学观察、器官指数检测、性激素分析、精子形态和数量测定以及H&E染色来评估DON的毒性。利用scRNA-seq技术解析DON诱导的睾丸损伤的细胞和分子机制。同时通过核扩散免疫染色、Western blot实验及抑制剂处理来验证DON的毒性作用。
结果
在性成熟大鼠中，长期暴露于DON会导致睾丸结构损伤、激素失衡及精子质量下降。对70,000个睾丸细胞进行scRNA-seq分析后发现，DON导致早期精原细胞异常积累。进一步分析表明，减数分裂过程中的减数分裂前期（leptotene stage）出现异常，相关基因（如Brca2和Rad51）表达受到抑制，染色体配对也发生紊乱。SCENIC调控网络分析显示KDM5A在减数分裂前期精原细胞成熟过程中起关键作用，且其活性被DON抑制。值得注意的是，使用激动剂D18激活KDM5A后，BRCA2和RAD51的表达恢复，减数分裂进程部分得到恢复，DON暴露模型中的精子缺陷也有所改善。
结论
本研究首次建立了DON诱导睾丸损伤的单细胞图谱，并确定KDM5A是霉菌毒素影响精子发生过程中关键调控网络的组成部分。这些发现为霉菌毒素相关男性不育提供了分子机制上的见解，并为相关治疗提供了潜在方向。
引言
不孕症是全球主要的健康问题，影响着约10-20%的育龄夫妇，其中男性因素是30-50%病例的直接或间接原因（世界卫生组织，2023年；Eisenberg等，2023年）。男性不育会带来严重的心理和社会压力，并给患者带来经济负担（Agarwal等，2021年）。全球疾病负担调查显示，男性不孕症的发病率每年增加0.291%（Sun等，2019年）。精子发生和精子质量对男性生育能力至关重要，睾丸中的精子发生障碍是导致男性不育的主要原因之一。多种因素（包括但不限于睾丸功能障碍、内分泌疾病、生活方式因素、生殖腺毒性暴露、营养状况及衰老）均可能导致男性不育（Eisenberg等，2023年）。其中，饮食或环境中的毒素（尤其是真菌产生的霉菌毒素）已被证实是男性不育的重要诱因（Yang等，2024年）。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），又称呕吐毒素，近年来成为全球关注的焦点。DON属于镰刀菌族产生的主要霉菌毒素，常见于中药、谷物以及肉类、鸡蛋和牛奶等动物产品中（Yang等，2024年；D?nicke和Brezina，2013年；Wang等，2024年）。DON最显著的物理化学特性是其耐高温性（高达350°C），因此能耐受烹饪和烘焙过程（Brera等，2023年）。由于其在全球范围内的普遍存在，DON暴露已成为全球性议题。欧洲食品安全局（EFSA）、联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）等国际机构已对其毒性、流行病学和代谢过程进行了广泛研究。根据FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会（JFECFA）和EFSA的评估，DON的每日允许摄入量上限为1 μg/kg体重（FAO/WHO，2011年；欧洲食品安全局，2014年）。然而，最新研究表明多数国家（如巴西、中国、俄罗斯和美国）的DON浓度均超过了这一标准（Mishra等，2020年），这使得DON的毒性问题具有全球性挑战。
DON经口服后迅速被吸收并广泛分布于肝脏、肾脏和肠道等器官。不同物种间的DON毒代动力学和代谢途径存在差异，导致敏感性不同，通常猪和人类的敏感性高于小鼠和大鼠，而家禽相对耐受性更强（Sun等，2022年）。在动物体内，DON主要通过II相结合反应和肠道微生物转化代谢；II相代谢产物包括葡萄糖醛酸酯和硫酸酯（如脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖醛酸酯和脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-硫酸酯），而肠道微生物群则将其转化为毒性较低的代谢物深脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Sun等，2022年）。DON对动物和人类的毒性作用多样，主要包括肠道毒性、肝毒性和肾毒性以及生殖毒性，其中对睾丸和精子发生的毒性尤为突出（Zhang等，2024年）。DON的生殖毒性严重影响大多数哺乳动物的生育能力，且其毒性因物种和生殖状态而异（Deng等，2023年）。在三周龄ICR小鼠中，连续三周给予DON会导致睾丸精子细胞丢失、睾丸间质出现炎症细胞、活精子数量减少及精子畸形率增加（Ruan等，2024年）。在三周龄SD大鼠中，一周内口服DON会促进Leydig细胞增殖但抑制其成熟和功能（Yang等，2024年）。多项研究探讨了DON对睾丸的毒性机制，提出了焦亡（pyroptosis）和铁死亡（ferroptosis）等可能机制（Ruan等，2024年；Yang等，2023年）。然而，DON在单细胞水平上如何影响睾丸功能（尤其是精子发生过程）仍需进一步研究。
精子发生是一个严格调控的过程，发生在睾丸的生精小管内，发育中的生殖细胞依次经历精原细胞、精原细胞、精母细胞最终形成精子。正常的精子发生需要众多基因在细胞水平和转录后水平上的精确时空表达和相互作用（Huang等，2023年）。传统的批量RNA测序方法难以准确反映睾丸中特定细胞类型的基因表达情况（Zhang等，2023年）。近年来，单细胞RNA测序（ScRNA-seq）技术的发展使得能够以单细胞分辨率全面分析单个细胞的转录基因信息。ScRNA-seq在揭示转录异质性、探索细胞复杂性的未知动态、确定特定细胞的发育路径及建立细胞间复杂相互作用网络方面具有显著优势（Zeng等，2023年）。
本研究对睾丸组织进行scRNA-seq分析，以探究DON在单细胞水平上的生殖毒性机制。所得数据通过免疫荧光共定位等多种方法进行了深入验证。我们的研究结果有望为理解DON诱导的睾丸损伤提供新见解，并为DON相关毒性的研究提供新靶点。
动物与DON处理
所有动物实验均获得成都中医药大学动物伦理委员会的批准（批准编号2023662），并遵循《动物研究：体内实验报告指南》（ARRIVE）进行。实验所用SPF级6周龄雄性SD大鼠和C57BL/6小鼠来自北京思培富生物技术有限公司。所有动物生活在12小时光照-黑暗循环环境中，可自由获取食物和水。
适应一周后...
DON暴露损害睾丸功能
暴露于DON28天后，睾丸大小和指数呈剂量依赖性下降（图1B,C）。附睾系数也呈现类似趋势（图1D）。性激素（包括睾酮T、促卵泡激素FSH、黄体生成素LH和抑制素B INHB）与精子发生密切相关（Neto等，2016年），因此我们测量了这些激素的血清水平。与对照组相比...
讨论
男性不育是全球性的公共卫生问题。霉菌毒素是导致男性不育的常见因素，广泛存在于食品、饲料和草药中。DON是一种备受关注的霉菌毒素，已有大量研究探讨其毒性机制。但目前尚无研究在单细胞水平上评估其对睾丸的影响。因此，本研究旨在填补这一空白，探讨DON对不同类型细胞的特异性影响。
结论
总之，本研究提供了单细胞层面的证据，证明长期DON暴露会通过干扰减数分裂前期精原细胞（L.SPC）的转化过程来损害睾丸功能。机制上，DON暴露导致转录因子KDM5A活性抑制，相关基因（如Brca2和Rad51）表达减少，进而影响减数分裂进程所需的BRCA2–RAD51轴的稳定性。
未引用参考文献
Dunce和Davies，2024年9月27日
CRediT作者贡献声明
吴文峰：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、资金申请、数据管理、概念构思。张丹丹：数据验证、方法学设计。冯慧：方法学设计。赵晨：方法学设计。何洁红：方法学设计。唐鹏兆：方法学设计。周耀川：方法学设计。吴金璐：方法学设计。常德贵：概念构思。于旭军：监督、实验设计、资金申请、概念构思。刘娟：撰写 – 审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号U24A20790, 82304850）、四川省科技计划（项目编号2024NSFJQ0044, 2024NSFSC0054）、国家中医药跨学科创新团队（项目编号ZYYCXTD-D-202209）、中国博士后科学基金会（项目编号2023MD734103）以及四川省中医药管理局（项目编号2022C001）的支持。
