苹果DEAD-box基因家族全基因组鉴定及低温胁迫下MdRH28功能验证

《Plant Physiology and Biochemistry》：Identification of the DEAD-box gene family in apple (Malus domestica) and functional verification of MdRH28 under low-temperature stress

本研究针对苹果低温胁迫耐受性机制不清的问题，通过全基因组鉴定筛选出134个DEAD-box家族基因，发现MdRH28在4°C低温下显著上调。功能验证表明，过表达MdRH28能通过提升抗氧化酶活性（SOD/POD/CAT）、调控激素平衡（ABA/IAA/GA3/ZT）及激活低温应答通路基因（CBFs/COR47），显著增强苹果愈伤组织和植株的低温耐受性，为果树抗寒育种提供新靶点。

　　

当寒潮来袭，果园中的苹果树如何应对低温挑战？这不仅是果农关心的问题，更是科学家们探索植物抗逆机制的重要课题。低温胁迫会破坏细胞膜稳定性，引发活性氧（ROS）爆发和光合系统损伤，最终导致果树减产甚至死亡。虽然此前研究发现转录因子和合成酶类基因在植物抗寒中发挥作用，但苹果中最大的RNA解旋酶家族——DEAD-box基因家族在低温应答中的功能仍属空白。

为解开这一谜题，甘肃农业大学园艺学院的研究团队在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表论文，首次系统鉴定了苹果全基因组中的134个DEAD-box家族基因，并聚焦于低温下显著响应的MdRH28基因，通过多组实验揭示了其增强苹果抗寒性的分子机制。这项研究不仅填补了苹果DEAD-box家族功能研究的空白，更为分子育种提供了宝贵的基因资源。

研究人员采用生物信息学分析结合实验验证的策略：首先通过HMMER和BLAST比对从苹果基因组数据库（GDDH13）中筛选家族成员，利用系统进化树和染色体共线性分析揭示基因家族进化特征；通过RT-qPCR检测基因表达模式；进而构建过表达和反义表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因苹果愈伤组织；同时利用病毒诱导基因沉默（VIGS）技术获得瞬时沉默植株；最后通过生理指标测定（MDA、REC、抗氧化酶活性、激素含量等）和基因表达分析验证功能。

3.1 苹果DEAD-box基因家族鉴定与分析

通过保守结构域分析鉴定出134个成员，命名为MdRH1-MdRH134。这些基因不均匀分布于17条染色体，片段重复是主要扩张方式。启动子分析发现富含激素和胁迫响应元件，表达谱显示MdRH28在低温胁迫下上调最显著。

3.2 MdRH28基因克隆与功能验证

成功克隆MdRH28并构建过表达（OE）和反义（Anti）载体。转基因愈伤实验表明，OE系在4°C处理15天后保持更好生长状态，鲜重比野生型（WT）高26.7%-30.2%，MDA含量和相对电导率（REC）显著降低，脯氨酸含量和SOD、POD、CAT活性升高，H₂O₂和O₂^-积累减少。激素检测发现OE系ABA含量升至WT的1.6倍，而IAA、GA₃、ZT分别降至56.2%、77.2%、51.1%。低温应答基因（CBF1/2/3、COR47、NCED1）表达显著上调。

3.5 MdRH28基因沉默降低苹果低温耐受性

VIGS沉默植株在低温下出现严重萎蔫，REC和MDA含量升高，叶绿素含量、净光合速率（Pn）和PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）下降，低温应答基因表达下调。DAB/NBT染色显示ROS积累加剧。

研究结论表明，MdRH28通过三重机制增强苹果低温耐受性：缓解膜脂过氧化和ROS积累、调节内源激素平衡（提升ABA并抑制生长激素）、激活ICE-CBF-COR信号通路。该基因的克隆与功能解析为果树抗寒育种提供了新靶点，其通过RNA解旋酶活性调控多重生理通路的作用模式，也为其他作物抗逆改良提供了理论参考。值得注意的是，MdRH28与同源基因的协同调控网络、其RNA底物特异性以及在不同苹果品种中的等位变异等功能细节，仍有待进一步探索。