《Plant Physiology and Biochemistry》：Rice NH2 Functions as a Positive Regulator of Salicylic Acid-Mediated Defense Responses against Sheath Blight Disease
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本研究针对水稻纹枯病抗性机制不清的难题，通过CRISPR/Cas9技术构建OsNH2基因敲除突变体，首次揭示OsNH2通过调控水杨酸(SA)信号通路正调控水稻对纹枯病和细菌性条斑病的抗性。研究发现OsNH2突变导致防御相关基因(OsWRKY45、OsPR1等)表达下调、内源SA水平降低，而外源SA处理可部分恢复抗性，为水稻抗病育种提供了新靶点。
水稻作为全球半数人口的主粮，其生产安全始终牵动人心。然而这种重要作物在生长过程中常遭遇纹枯病的严重威胁——这是一种由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的毁灭性真菌病害，在印度等主要稻区可造成高达50%的产量损失。更棘手的是，由于病原菌进化快速且抗病资源稀缺，传统育种手段难以培育出持久抗病品种。
在植物免疫系统中，水杨酸(SA)信号通路犹如一道精密警报系统，而NPR1基因家族正是这个系统的核心调控者。虽然水稻中存在5个NPR同源基因(NH1-NH5)，但科学界对OsNH1和OsNH3的功能已有较多了解，而对OsNH2在抗病中的作用却一直模糊不清。这就像拼图中缺失的关键一块，阻碍我们全面理解水稻抗病机制。
为解开这个谜团，印度泰米尔纳德农业大学的研究团队在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表创新研究。他们运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在感病品种ASD16和中抗品种CO51中成功构建了OsNH2敲除突变体。通过多组学方法，包括病原接种实验、基因表达分析、激素测定和蛋白互作预测，系统解析了OsNH2的功能。
关键技术方法包括：利用CRISPR/Cas9构建OsNH2基因敲除突变体；采用离体叶片和整株接种法进行纹枯病和细菌性条斑病抗性评价；通过qRT-PCR分析防御基因表达；使用UHPLC-MS/MS测定水杨酸含量；结合NBT染色和扫描电镜观察病原侵染过程。
开发OsNH2敲除突变体及其分子特征
研究人员设计两个sgRNA靶向OsNH2基因第二外显子，通过农杆菌介导转化获得39个突变株系。最终筛选出5个移码突变体和2个框内缺失突变体。蛋白结构分析显示，突变导致BTB/POZ结构域、钾离子通道、锚蛋白重复序列和NPR1/NIM1-like防御结构域功能受损。
OsNH2纯合突变体(T2)对立枯丝核菌和白叶枯病菌感染的生物测定
纹枯病接种实验显示，突变体病斑面积显著大于野生型：ASD16背景中野生型病斑为1.53cm2，而突变体达2.48-3.72cm2；CO51背景中野生型为0.93cm2，突变体为1.83-2.94cm2。白叶枯病接种也呈现类似趋势，突变体病斑长度显著增加，表明OsNH2对两种病原均具有广谱抗性。
OsNH2突变体叶片感染立枯丝核菌AG1-1A后的ROS积累和SEM分析
NBT染色显示突变体超氧化物积累显著增加，扫描电镜观察到突变体菌丝密度更高、分支更多，并形成侵染垫结构，表明OsNH2缺失增强了真菌定殖能力。
OsNH2突变体感染立枯丝核菌AG1-1A后防御相关基因的表达
qRT-PCR分析发现，突变体中WRKY转录因子(OsWRKY45、OsWRKY4、OsWRKY80)和TGA转录因子(OsTGA2、OsTGA3)表达显著下调。病程相关蛋白基因(OsPR1、OsPR3、OsPR5、OsPR10)也呈现类似表达模式，揭示OsNH2通过调控这些防御基因表达参与抗病反应。
OsNH2突变体中OsNH1、OsNH3和SA生物合成基因的表达水平分析
OsNH2突变导致OsNH1和OsNH3表达显著降低，SA生物合成基因(OsPAL和OsICS1)诱导表达减弱。有趣的是，立枯丝核菌感染可诱导野生型中OsNH2表达上调，表明其参与病原响应。
外源施用植物激素对OsNH2突变体在立枯丝核菌AG1-1A感染期间的影响
外源SA处理可部分恢复突变体抗性，病斑面积减小，OsNH1/3表达上调，但未能完全恢复至野生型水平。内源SA测定显示，感染后突变体SA积累量(112.46μg/g)显著低于野生型(163.81μg/g)，且CO51品种基础SA水平高于ASD16，可能解释其固有抗性差异。
研究结论表明，OsNH2是水稻SA信号通路的关键正调控因子，与OsNH1和OsNH3协同工作，通过调控WRKY和TGA转录因子网络，激活PR基因表达，从而赋予对纹枯病和细菌性条斑病的广谱抗性。分子对接预测显示OsNH2与SA具有最强结合亲和力(-6.1 kcal mol-1)，提示其可能作为SA受体发挥作用。
这项研究不仅填补了水稻NPR基因家族功能研究的空白，更重要的是为分子育种提供了新靶点。通过调控OsNH2表达，有望培育出具有持久抗病性的水稻新品种，对保障全球粮食安全具有重要意义。未来研究可进一步解析OsNH2与其它NH家族成员的互作网络，探索其在抗病信号通路中的精确分子机制。
