可现场部署的CRISPR-Cas变体，用于快速检测植物病原体

《Plant Science》：Field-deployable CRISPR-Cas variants for rapid on-site detection of plant pathogens

植物病害快速检测技术；CRISPR-Cas12a；侧流试纸；Cas13a RT-RPA；电化学传感器；便携式诊断平台|

希曼舒·萨伊尼（Himanshu Saini）|乔蒂·亚达夫（Jyoti Yadav）|沙拉德·潘迪（Sharad Pandey）|阿南德·库马尔（Anand Kumar）|迪帕克·南达（Deepak Nanda）|沙拉德·萨昌（Sharad Sachan）|吉万·乔蒂·考希克（Jeevan Jyoti Kaushik）

印度北阿坎德邦德赫拉杜恩（Dehradun）德夫布米大学（Dev Bhoomi Uttarakhand University）农业学院，邮编248007

摘要

快速、可在田间使用的诊断方法对于有效的植物病害管理至关重要。尽管CRISPR-Cas系统具有高灵敏度和可编程性，但由于缺乏标准化、实用的工作流程，其在现场植物病原体检测中的应用受到了限制。本文介绍了使用Cas12a、Cas13a和微型Cas变体实现的CRISPR-Cas诊断方案，用于快速检测主要植物病原体。文中描述了三种适用于田间的检测方法：(i) 用于DNA病原体的RPA-Cas12a侧向流动检测方法；(ii) 用于RNA病毒的Cas13a RT-RPA检测方法；(iii) 适用于便携式实验室的无扩增Cas12a电化学生物传感器。每种方案都包括样品制备步骤、试剂配方、孵育条件及故障排除指南。在各种平台上，检测限达到1-100拷贝/μL?1，检测时间仅需20-45分钟，显示出与传统基于PCR的诊断方法相当的分析灵敏度，同时显著缩短了检测时间并提高了现场应用性。我们还讨论了实际操作中的限制因素，如样品抑制剂、试剂稳定性及生物安全问题，并提出了相应的解决方案。这些标准化的工作流程将CRISPR诊断技术的最新进展转化为可重复、适用于田间的工具，用于植物健康监测和快速病害检测。

引言

植物病害继续对全球粮食生产构成严重且持续的威胁。在主要种植系统中，病毒、细菌、真菌、线虫和卵菌等病原体每年导致20-40%的产量损失，经济损失达数百亿美元（CABI, 2025; FAO, 2025; Savary等人, 2019）。这些损失不仅削弱了农业生产能力，还危及粮食安全、农村生计和国际贸易。气候变化导致的病原体流行趋势、植物材料全球流动以及高致病性病原体的快速进化进一步加剧了风险，迫切需要早期、准确的病害检测（Chaloner等人, 2021）。

及时识别植物病原体是有效管理病害、根除病害和实施检疫的关键。传统的诊断方法如聚合酶链反应（PCR）、定量PCR（qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和环介导等温扩增（LAMP）长期以来一直是植物病原体检测的核心。虽然这些实验室技术具有高分析灵敏度和特异性，但在非控制环境下使用时存在诸多实际限制。PCR和qPCR需要热循环仪、不间断电源和受过培训的人员，因此不适合快速田间应用（Mumford等人, 2016）。ELISA虽然简单且成本低廉，但通常缺乏早期检测低滴度感染所需的灵敏度（Ward等人, 2004）。LAMP提供了更便携的等温扩增方式，但其复杂的引物设计和偶尔出现的假阳性反应限制了其在多变田间条件下的可靠性（Notomi等人, 2015）。

近年来，CRISPR-Cas系统作为分子诊断的多功能平台崭露头角，利用其天然的序列特异性核酸识别能力。第二类CRISPR效应子如Cas12a、Cas12b、Cas13a和较小的Cas蛋白（例如Cas12f/Cas14）具有独特的生化特性，可实现对DNA或RNA目标的快速敏感检测。Cas12型酶在结合目标后能识别DNA序列并触发附近单链DNA的报告基因的切割，产生可见信号（Chen等人, 2018）。类似地，Cas13酶能识别RNA并激活强效的RNase活性，通过荧光或侧向流动检测方法检测植物RNA病毒（Gootenberg等人, 2017）。微型Cas变体（如Cas12f和Cas14）体积小巧、PAM（保护性寡核苷酸）要求简单，且适应资源匮乏的环境，使其成为便携式诊断设备的理想候选者（Harrington等人, 2018）。

这些特性推动了新一代基于CRISPR的诊断平台的发展，包括DETECTR（Cas12a）、SHERLOCK（Cas13a）、HOLMES（Cas12a）和FELUDA（FnCas9），这些平台已成功应用于人类、兽医和环境检测领域。植物病理学也从中受益：最新研究表明，基于Cas13a的检测方法可用于早期检测植物RNA病毒（Karimi等人, 2025），基于Cas12a的工作流程可用于检测如Alternaria等真菌病原体（Shaizadinova等人, 2025），以及集成智能手机的RPA-Cas12a系统用于检测Phytophthora infestans（Zhao等人, 2025）。这些发现凸显了CRISPR诊断技术在克服传统工具局限性方面的潜力，提供了快速、等温、用户友好的检测方法，适用于现场使用。

尽管取得了这些进展，但仍存在一个主要障碍：针对植物病原体的CRISPR-Cas诊断方法很少以完整的、可复制的方案形式呈现。大多数已发表的研究仅展示了概念验证，但常省略了关键的操作细节，如适用于田间的样品提取、试剂稳定性、孵育条件、侧向流动结果的解读、故障排除和质量控制步骤，而这些步骤对于植物健康专业人员的实际应用至关重要。正如该领域的研究人员所指出的，缺乏可实施的方案限制了CRISPR检测方法从实验室原型向真正用于植物病害监测、检疫筛查和快速田间诊断工具的转化。

为解决这一差距，本文提供了标准化、适用于田间的CRISPR-Cas诊断工作流程，专为资源有限和现场条件设计。我们开发了三种可实施的检测方案：

1.

用于DNA病原体（如细菌和真菌）的RPA-Cas12a侧向流动检测方法，

2.

用于RNA病毒的快速Cas13a RT-RPA检测方法，以及

3.

适用于便携式或移动实验室的无扩增Cas12a电化学生物传感器。

每种工作流程都配有详细的步骤指南、试剂配方、孵育条件、样品制备方法、故障排除指南、试剂稳定策略以及集成选项（如基于智能手机的读数）。通过将基于CRISPR的检测方法从概念验证转化为实际操作方法，本文旨在加速诊断实验室、推广网络、植物检疫检查员和从事植物病害监测的研究团队的采用。

材料与方法

本研究开发并优化了三种基于CRISPR-Cas的诊断工作流程，用于快速、可在田间使用的植物病原体检测。所有方案均经过标准化处理，以确保在不同环境条件下的可重复性，并解决了实际应用和可访问性的问题。工作流程包括：(i) 用于DNA病原体的重组酶聚合酶扩增（RPA）-Cas12a侧向流动检测（LFA）；(ii) 基于Cas13a的RT-RPA检测方法用于

三种可田间应用的CRISPR-Cas诊断工作流程的建立

我们成功开发并优化了三种互补的基于CRISPR的诊断工作流程：RPA-Cas12a侧向流动检测方法、Cas13a RT-RPA荧光检测方法以及无扩增的Cas12a电化学生物传感器，每种方法均针对不同类型的植物病原体和不同的操作环境进行了优化。（表1）总结了每种工作流程的诊断目的、核心生化机制和配置。如图1所示，

讨论

本研究提出了一套三种可田间应用的CRISPR-Cas诊断工作流程，以满足植物病害监测的实际需求。通过整合RPA-Cas12a侧向流动检测、Cas13a RT-RPA荧光检测和无扩增的Cas12a电化学生物传感器，我们展示了一个统一而灵活的框架，适用于多种植物样本和操作环境。综合结果表明，基于CRISPR的技术

优势

本研究开发的诊断工作流程为植物病害监测提供了多项实质性优势。其主要优势在于利用了Cas12a和Cas13a酶的天然生化特性进行设计。如前所述，Cas12a的dsDNA触发型ssDNA切割和Cas13a的RNA靶向转RNase激活机制使得检测系统具有高度灵敏性和多功能性。这一机制基础确保了每种

结论

本研究建立了一套稳健且实用的基于CRISPR-Cas的诊断工作流程，适用于现场植物病原体检测。通过整合RPA-Cas12a侧向流动检测、Cas13a RT-RPA荧光检测和无扩增的Cas12a电化学平台，我们证明了CRISPR技术可以高效转化为便携式、试剂稳定的格式，适用于田间应用，同时不牺牲分析灵敏度或特异性。

未引用的参考文献

(Chen等人, (2023)

资助

本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。

CRediT作者贡献声明

希曼舒·萨伊尼（Himanshu Saini）：撰写 – 审稿与编辑；撰写 – 原稿。沙拉德·潘迪（Sharad Pandey）：撰写 – 审稿与编辑。乔蒂·亚达夫（Jyoti Yadav）：撰写 – 审稿与编辑；可视化。沙拉德·萨昌（Sharad Sachan）：撰写 – 审稿与编辑。阿南德·库马尔（Anand Kumar）：数据管理；概念构思。迪帕克·南达（Deepak Nanda）：撰写 – 审稿与编辑。吉万·乔蒂·考希克（Jeevan Jyoti Kaushik）：监督；资源协调。

利益冲突声明

作者声明没有已知的经济或非经济利益冲突。

致谢

我要感谢所有合作者的贡献。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文研究的已知经济或个人关系。