AP2/ERF家族成员的转录组分析以及CaAP2/ERF99在辣椒抵御Phytophthora capsici中的功能特性研究

《Plant Science》：Transcriptome profiling of AP2/ERF family members and functional characterization of CaAP2/ERF99 in pepper defense against Phytophthora capsici

辣椒疫病由卵菌病原体Phytophthora capsici引起，AP2/ERF转录因子在植物抗病中起关键作用。本研究通过转录组分析发现CaAP2/ERF99基因在抗病品种（CM334）和感病品种（EC01）感染后3小时显著上调，其过表达减少病斑面积和病原体生物量，沉默则降低抗性。该基因通过激活PR1、PR10、LOX1等防御基因，协同SA、MeJA、ETH激素信号通路介导抗病。

王杰|穆罕默德·阿齐姆|李亚伟|龚蓓蓓|李学琪|刘莉|吴光强|储茉莉|程伟

安徽师范大学生命科学学院，中国芜湖241000

摘要

由著名卵菌病原体Phytophthora capsici引起的Phytophthora枯萎病是全球辣椒种植中的一种毁灭性病害。转录因子（TFs）在病原体攻击期间调节宿主免疫网络中起着关键作用。其中，APETALA2/乙烯响应因子（AP2/ERF）家族是最大的植物特异性TFs群体，对植物的生长、发育和胁迫适应至关重要。然而，它们在辣椒抗P. capsici中的转录谱和功能作用仍大部分未被探索。在本研究中，我们通过转录组分析鉴定了抗性（CM334）和感性（EC01）辣椒品系在P. capsici感染后的AP2/ERF TFs表达情况。差异表达分析发现了一个ERF亚家族基因CaAP2/ERF99，该基因在感染后3小时内在这两个品系中均显著上调，表明其在基础防御中发挥作用。RT-qPCR进一步验证了其早期响应表达模式，亚细胞定位确认了其核定位。此外，外源处理水杨酸（SA）、甲基茉莉酸（MeJA）和乙烯利（ETH）显著诱导了CaAP2/ERF99的表达，表明其与激素介导的防御信号传导有关。功能丧失和获得实验表明，在辣椒叶片中短暂过表达CaAP2/ERF99可显著减小病斑大小和P. capsici生物量，但沉默该基因会降低抗病性。进一步的转录调控分析显示，CaAP2/ERF99激活了包括CaPR1、CaPR10、CaLOX1、CaChi2和CaDEF1在内的广泛防御相关基因。总体而言，这些结果表明CaAP2/ERF99在辣椒对抗P. capsici的防御反应中具有正向调节作用，是增强抗Phytophthora枯萎病潜力的候选基因。

引言

辣椒（Capsicum annuum）是一种全球重要的蔬菜作物，其产量受到卵菌病原体Phytophthora capsici的严重威胁。这种病原体可感染至少26个植物科，经常导致严重的产量损失，从而对农业和全球粮食安全构成严重威胁。在温暖（25~28°C）和潮湿条件下，特别是在雨季，P. capsici可以感染辣椒植株的几乎所有部分，引起根腐病、茎枯病、叶坏死和果实腐烂（Barchenger等人，2018；Kamoun等人，2015；Quesada-Ocampo等人，2023；Sanogo等人，2023）。在幼苗中，根腐病引起的猝倒病可在2-5天内导致植株死亡；而在成熟植株中，根部感染通常会导致萎蔫、生长受阻并在两周内死亡（Bagheri等人，2020；Dunn和Smart，2015；Granke等人，2012；Kaur等人，2024）。

控制这种病原体的措施包括轮作、灌溉管理、土壤熏蒸和杀菌剂施用；然而，这些策略仅部分有效（Barchenger等人，2018；Kaur等人，2024）。培育抗性品种被认为是最有效和可持续的方法；然而，这受到抗性性状复杂遗传性的阻碍（Lozada等人，2021；Quesada-Ocampo等人，2023）。墨西哥地方品种‘Criollo de Morelos 334’（CM334）是一种已充分研究的P. capsici抗性来源，被广泛用于育种计划。尽管如此，尚未开发出具有更高抗性的商业辣椒品种（Barchenger等人，2018；Kamoun等人，2015）。这些限制凸显了更好地理解辣椒抗P. capsici分子机制的必要性，这可能为遗传改良提供新的候选基因。

在与微生物病原体的共同进化过程中，植物发展出了多层次的防御机制来对抗病原体入侵。这些反应涉及广泛的转录重编程，由转录因子（TFs）介导，它们通过结合到启动子中的cis元件来调节防御相关基因的表达（Brunello等人，2025；Chai等人，2022；Cheng等人，2020；Singh等人，2002；Tezuka等人，2019）。在植物TF家族中，APETALA2/乙烯响应因子（AP2/ERF）超家族是最大的群体之一，对植物的生长、发育和胁迫适应至关重要（Feng等人，2020；Licausi等人，2013）。根据结构域组成，该超家族分为五个亚家族：AP2、DREB、ERF、RAV和Soloist（Ma等人，2024）。ERF亚家族由一个AP2结构域定义，特别参与植物对生物和非生物胁迫的响应（Ma等人，2024；Su等人，2025）。最初在烟草中发现，ERF TFs能够结合致病相关（PR）基因启动子中的GCC-box基序，此后在多种植物物种中得到了广泛研究（Feng等人，2020；Jin等人，2018；Shu等人，2016；Zhang等人，2024）。这些发现表明ERF TFs参与植物防御信号传导，使其成为研究辣椒与P. capsici相互作用的功能性候选基因。

高通量测序技术的发展进一步使得在多种植物物种中全基因组范围内鉴定AP2/ERF基因家族成员成为可能，包括Arabidopsis thaliana（Nakano等人，2006）、Arachis duranensis（Prasad等人，2018）、C. annuum（Jin等人，2018）、Elaeis guineensis（Zhou和Yarra，2021）、Helianthus annuus（Najafi等人，2018）、Morus notabilis（Dou等人，2024）、Oryza sativa（Nakano等人，2006）、Zea mays（Zhou等人，2012）和Solanum melongena（Li等人，2021）。特别是ERF亚家族在介导植物对病原体攻击的响应中起着关键作用（Nakano等人，2006）。例如，在水稻中过表达OsERF83可增强其对真菌病原体Magnaporthe oryzae的抗性（Tezuka等人，2019），而在Arabidopsis中AtERF11可激活BT4的转录表达，提高对细菌病原体Pseudomonas syringae的抗性（Zheng等人，2019）。在苹果中，MdERF11调节乙烯（ET）信号通路，增强对Botryosphaeria dothidea的免疫反应（Wang等人，2020a）。在葡萄中，转基因Arabidopsis中过表达< /> TFs可增强对Botrytis cinerea和Pseudomonas syringae的抗性，这是通过调节多种激素信号通路实现的，包括水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和ET（Wang等人，2020b）。同样，在葡萄中短暂过表达< />可通过SA和JA/ET信号通路增强对B. cinerea和Pseudomonas syringae DC3000的抗性（Zhu等人，2022）。辣椒基因组编码175个AP2/ERF TFs（Jin等人，2018），据推测ERF亚家族成员CaPTI1参与对抗P. capsici的防御（Jin等人，2016）。然而，辣椒AP2/ERF基因在P. capsici感染下的全局转录谱和功能研究仍大部分未被探索。

在本研究中，我们系统分析了抗性和感性辣椒品系在P. capsici感染后的AP2/ERF TFs转录组谱。然后，我们鉴定出一个ERF亚家族基因CaAP2/ERF99，显示出早期响应表达模式，并证明它对辣椒的抗P. capsici具有正向调节作用。此外，外源处理水杨酸（SA）、甲基茉莉酸（MeJA）和乙烯利（ETH）可强烈诱导CaAP2/ERF99的表达，它通过激活广泛的防御相关基因发挥正向调节作用，突显了其在遗传改良抗Phytophthora枯萎病中的潜力。

部分内容片段

植物材料、病原体和培养条件

辣椒植株在塑料盆中种植，盆内土壤混合物为珍珠岩和泥炭藓（1:2，体积比），在生长室中按照先前描述的条件进行培养（Cheng等人，2020）。P. capsici菌株JX1首先在10% V8琼脂平板上于25°C的黑暗环境中培养。随后，菌丝体转移到10%液体V8培养基中，在25°C的黑暗环境中培养3天。为了诱导孢子囊的形成和游动孢子的释放，菌丝体被清洗了三次

在P. capsici感染期间辣椒中差异表达的AP2/ERF转录因子的鉴定

辣椒基因组编码175个潜在的CaAP2/ERF TFs，每个TF都含有保守的AP2/ERF结构域（Jin等人，2018）。为了研究它们在病原体感染期间的转录动态，我们分析了抗性（CM334）和感性（EC01）辣椒品系在P. capsici接种后的时间序列转录组数据（Cheng等人，2020）。如图1A所示，EC01表现出严重的病害症状，包括快速萎蔫和植株死亡，而CM334则没有。我们鉴定了

讨论

卵菌病原体P. capsici是导致辣椒枯萎病最严重的病原体之一，造成全球范围内的显著产量损失（Barchenger等人，2018；Kamoun等人，2015；Quesada-Ocampo等人，2023；Sanogo等人，2023）。尽管卵菌历史上被归类为真菌，但它们在系统发育上属于Stramenopiles分支，该分支还包括硅藻和褐藻（Granke等人，2012；Quesada-Ocampo等人，2023）。P. capsici可以感染多种植物

结论

在本研究中，我们使用时间序列转录组分析鉴定了抗性和感性辣椒品系在P. capsici感染下的AP2/ERF TFs表达情况。结果显示，抗性辣椒品系通过快速激活更多早期诱导的CaAP2/ERF基因来应对P. capsici，而感性植株则表现出更多中期/晚期诱导和下调的基因。差异表达分析发现了一个ERF亚家族基因CaAP2/ERF99

CRediT作者贡献声明

Muhammad Azeem：撰写——初稿，研究。Yawei Li：撰写——审阅与编辑，研究，概念化。Jie Wang：撰写——初稿，研究，概念化。Wei Cheng：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取。Guangqiang Wu：研究。Moli Chu：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取。Xueqi Li：研究。Li Liu：研究。Beibei Gong：研究。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号32472536，项目编号32302526）、安徽省自然科学基金（项目编号2208085MC64）、安徽省高校分子酶学与检测杰出创新研究团队（项目编号2022AH010012）、安徽省大学协同创新计划（项目编号GXXT-2022-067）以及安徽省大学自然科学研究计划的支持