一种基于分裂crRNA的新型光控CRISPR-Cas12a系统，可实现多种病毒气溶胶的一锅法检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：A novel photo-controlled CRISPR-Cas12a system based on split crRNA for one-pot detection of multiple viral aerosols

【字体：大中小】 时间：2026年02月07日 来源：Sensors and Actuators B: Chemical 7.7

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　　本研究开发了一种基于split crRNA的光控CRISPR-Cas12a检测系统，并与RT-RPA技术整合，构建了一体化“一步法”气溶胶病毒检测平台。该系统可在1小时内完成从气溶胶样本采集到检测信号输出的全流程，检测限低至100 aM，并实现H7N9流感病毒与SARS-CoV-2的同步检测及可视化诊断，解决了传统光控策略定制成本高、优化繁琐的问题，为便携式病毒气溶胶监测提供了新方案。

作者名单：范泽|尹晓云|杜斌|刘志伟|徐继伟|穆西辉|刘冰|徐建杰|童朝阳

中国北京102205，国家NBC危害防护化学重点实验室

摘要

CRISPR-Cas12技术彻底改变了核酸检测领域。尽管气溶胶是流行病毒的重要传播途径，但目前大多数基于CRISPR的检测技术都集中在液体样本上。直接检测气溶胶中的病毒仍然较为罕见。在这项研究中，我们设计了一种新型的光控CRISPR-Cas12a检测系统，该系统基于分裂的crRNA，并将其与逆转录-重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）技术结合，开发出一种用于检测气溶胶中病毒的“一锅法”检测方案。通过整合病毒气溶胶捕获和核酸富集的过程，该系统能够在1小时内完成从气溶胶样本输入到检测信号输出的全过程。本研究构建的模块化光控CRISPR-Cas12a系统解决了传统光控策略中的问题，如需要为不同目标定制阻断序列以及系统优化过程繁琐等问题。它提供了一种通用的分子工具，可用于检测多种病毒，显著降低了设计成本，并能够同时检测和预警气溶胶中的H7N9流感病毒和SARS-CoV-2。这项研究标志着光控CRISPR技术首次应用于病毒气溶胶检测领域，建立了一个集成的病毒气溶胶检测平台，支持荧光检测和基于LFA的可视化检测，适用于低浓度病毒。该平台为多样化的检测需求提供了准确、灵敏、快速且易于操作的通用技术解决方案，对预防和控制病毒传播具有实际价值。

引言

高致病性呼吸道病毒通过气溶胶传播已成为全球公共卫生的核心威胁。研究表明，直径小于5微米的病毒气溶胶可以在空气中悬浮1-3小时，最大传播距离超过10米。这种空气传播特性大大扩展了暴露人群的范围（图1A、B）[1]、[2]、[3]。准确识别环境气溶胶中的病毒对于切断呼吸道病原体的传播链至关重要。这也是早期疫情预警系统的关键技术支柱，它能够在症状出现之前在拥挤区域检测到病毒信号，并通过持续监测追踪传播轨迹和突变趋势，因此对公共卫生预防和控制具有重要意义[4]、[5]。

目前，生物气溶胶分析领域已经发展出了多种分析方法，包括免疫测定[6]、[7]、实时定量聚合酶链反应（qPCR）[8]、[9]、[10]、ATP发光法[11]、平板计数法[12]等（图1C）[13]。病毒气溶胶的监测主要依赖于qPCR和集成自动化设备。对于qPCR技术，病毒颗粒首先通过生物气溶胶采样器捕获，然后在实验室环境中进行核酸提取和扩增分析。尽管应用广泛，但由于其对实验室环境和热循环仪的依赖性，严重限制了其在即时检测（POCT）中的应用[14]、[15]。虽然集成自动化设备可以整合多个步骤并实现高灵敏度，但其缺点包括响应时间慢、设备体积大和部署成本高[16]、[17]。因此，开发具有快速响应、高灵敏度、小型化和低成本特性的新型传感器对于提升公共卫生应急响应能力至关重要。

理想的气溶胶监测系统必须同时满足高灵敏度和快速响应的核心要求。在这种情况下，基于CRISPR的一锅法检测技术显示出显著优势：它消除了对复杂热循环仪的需求，能够在37℃下实现目标核酸的扩增和检测，并在短时间内生成可检测信号[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。其中，光控CRISPR-Cas12a系统结合了光敏元件，能够在单管内实现时空控制[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。在扩增阶段，系统会抑制CRISPR活性以防止模板降解；扩增完成后，光照会激活Cas12a的切割功能以触发信号生成。这不仅克服了传统一锅法中扩增和切割之间的互斥瓶颈，还消除了开管导致的污染风险，显著提高了灵敏度和现场使用的适用性。因此，光控CRISPR一锅法检测技术有望成为下一代病毒气溶胶监测技术的核心解决方案。

在这项研究中，我们基于分裂的crRNA开发了一种新型的光控CRISPR-Cas12a系统[32]。在该系统中，crRNA被拆分为两个功能区域：一个保守的支架区域和一个可变的间隔区域。我们设计了一种光敏支架RNA：其支架区域被预先设计成自闭合构象，在光照下，PC连接子发生切割，促使支架RNA折叠成正确的活性构象。通过分别设计光敏支架RNA和间隔RNA，我们实现了检测系统的高度模块化设计。这种设计大大简化了优化过程。在检测不同目标RNA时，只需更换相应的间隔序列，而光敏支架RNA组件可以重复使用。随后，我们将这种光控CRISPR-Cas12a系统与RT-RPA技术结合，构建了一个“一锅法”检测系统。该系统在封闭环境中完成扩增和检测，有效避免了气溶胶污染的风险。进一步整合病毒气溶胶捕获和核酸富集过程[33]后，我们成功检测到了气溶胶中的MS2噬菌体。从气溶胶收集到信号输出的整个检测工作流程可以在1小时内完成，病毒RNA的检测限（LOD）低至100 aM。此外，我们将该检测系统与侧向流式检测（LFA）条结合，实现了病毒气溶胶检测信号的可视化。最后，通过设计针对不同病毒的间隔序列，我们实现了对气溶胶中H7N9流感病毒和SARS-CoV-2的同时预警以及可视化信号输出。

总之，本研究构建了一个完整的病毒气溶胶检测工作流程，能够检测气溶胶中的多种病毒。这一工作流程提供了一种通用的检测工具，以满足多样化的病毒气溶胶检测需求（图1D）。

部分内容摘录

病毒气溶胶的生成与收集

生理盐水被用作病毒颗粒的稀释基质，包括MS2噬菌体、M13噬菌体、H7N9伪病毒和SARS-CoV-2伪病毒。使用3喷头碰撞液体雾化器生成气溶胶。病毒颗粒被稀释到1.0×10^4–1.0×10^9 CFU/mL的系列浓度，然后分别注入多通道气溶胶生成设备中。在该设备中，生成了病毒气溶胶。

光控CRISPR系统的构建与验证

在这项研究中，基于分裂的crRNA构建了一个光敏crRNA支架结构（图1A）。具体来说，在支架结构的5’端引入了PC连接子和RNA序列（能够与支架的保守序列杂交），形成了一个非活性的RNA-RNA双链结构。在365纳米紫外光照射下，PC连接子发生切割，阻断序列解离。随后，支架结构恢复到其活性状态。

结论

本研究成功开发了一种基于分裂crRNA的光控CRISPR-Cas12a系统。随后，将该光控系统与RT-RPA结合，构建了一个光控CRISPR一锅法系统。该系统能够在1小时内完成从气溶胶样本输入到检测信号输出的全过程。为了进一步扩展该系统在POCT场景中的适用性，研究还将该系统与侧向流式检测（LFA）条结合，开发了一种可视化检测方法。

CRediT作者贡献声明

刘冰：数据可视化、形式分析。穆西辉：数据可视化、形式分析。徐继伟：数据可视化、形式分析。刘志伟：数据可视化、形式分析。徐建杰：数据可视化、形式分析。童朝阳：撰写——审稿与编辑、监督、研究调查、资金获取、概念构思。杜斌：数据可视化、形式分析。尹晓云：方法学设计、形式分析。范泽：撰写——初稿撰写、形式分析、数据管理、概念构思。