通过PAM结构重塑来编程激活Cas12a，以实现按需检测DNA修复酶

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Programming activation of Cas12a via PAM remodeling for on-demand detection of DNA repair enzymes

CRISPR/Cas12a通过酶促修复调控的PAM模块重构策略实现高灵敏快速检测，30分钟完成操作，兼容 lateral flow assay用于现场诊断。

　　

陈路遥|张秋宇|刘文静|张春阳

东南大学化学与化学工程学院，数字医学工程国家重点实验室，南京211189，中国

摘要

CRISPR/Cas12a系统在分子诊断和生物传感领域具有巨大潜力，这得益于其高度的可编程性和高效的切割活性。然而，目前调节Cas12a切割活性的方法通常涉及对CRISPR RNA（crRNA）进行复杂的结构修饰或使用昂贵的化学改构，这些方法限制了其广泛应用。在这里，我们提出了一种稳健且经济有效的策略，通过重塑发夹状双链DNA激活剂中的原间隔区序列（PAM）来编程激活Cas12a。我们合理设计了一种含有不完整PAM序列的发夹探针，使得Cas12a处于非活性状态。引入特定的DNA修复酶（例如尿嘧啶DNA糖基化酶）后，可以切除发夹探针中的尿嘧啶（U）碱基，从而启动聚合反应，使PAM结构恢复到可有效重新激活Cas12a的功能形式。这种集成策略不仅实现了对Cas12a切割活性的精确时间和层次控制，还便于构建一种通用传感平台（即CRISPR开关），用于按需检测各种修复酶。该检测方法具有实验步骤简单、分析时间短（30分钟）、高灵敏度和优异选择性等优点。重要的是，这种CRISPR开关可以与侧向流动分析（LFA）结合使用，实现快速直观的修复酶检测，适用于资源有限的现场诊断场景。

引言

簇状规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白（CRISPR/Cas）系统最初来源于原核生物的适应性免疫机制，由于RNA引导的Cas效应器的模块化可编程性，在基因工程、转录调控、生物成像和分子诊断等领域已成为革命性的工具[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。CRISPR/Cas12a（以前称为Cpf1，V-A亚型）作为CRISPR/Cas家族的成员，在生物传感应用中受到了广泛关注[6]、[7]。在CRISPR RNA（crRNA，由CRISPR阵列转录）的引导下，Cas12a能够精确切割相应的双链DNA（dsDNA）或单链DNA（ssDNA）目标，这一过程称为切割活性[8]、[9]。此外，Cas12a在目标识别后还表现出独特的切割活性（旁观效应），导致附近ssDNA分子的非特异性切割，具有较高的酶转化速率（约1250 s?1）[10]、[11]。基于这些特性，已经开发出了多种基于Cas12a的生物传感平台，如SHELOCK[12]、FINDER[13]、DECTOR[10]和CLIPON[14]。然而，基于CRISPR/Cas12a的生物传感器的设计往往较为复杂且通用性有限，难以适应需要可调活性的不同检测场景。因此，精确调节Cas12a的切割活性对于扩展其在多个领域的应用至关重要。

CRISPR/Cas12a系统的功能主要通过三个模块来调控：Cas12a蛋白、crRNA和DNA激活剂。尽管以往的研究主要集中在Cas12a蛋白或crRNA的工程改造上，例如光控、化学修饰、二聚化、crRNA环化及延伸[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]，但这些方法通常较为复杂、耗时且受特定条件限制，限制了其在常规诊断中的普遍应用。例如，光控方法需要引入昂贵的光敏基团（如PC连接剂），并严格优化其结合位点和数量以实现有效的“信号关闭”和“信号开启”转换[15]。除了引入光响应元件来调节crRNA外，crRNA结构的调整还可能影响其与Cas12a的结合亲和力。研究表明，crRNA 5′茎区的假结结构有助于Cas12a/crRNA复合物的组装[21]、[22]。通过延长crRNA的3′端或5′端来抑制CRISPR/Cas12a活性可能会破坏假结结构，随后可以通过触发分子恢复crRNA[23]、[24]、[25]。然而，由于长RNA具有复杂的二级结构且合成成本较高，这些方法仅适用于核酸检测。基于硼酸酯或乙酰转移酶的化学修饰策略仅适用于特定的细胞代谢物和分子，并且与复杂的生物样本兼容性较差[16]、[17]、[26]、[27]。此外，crRNA和DNA激活剂对Cas12a的直接高效激活难以实现精确的时间或层次控制，从而影响检测的灵敏度和选择性。相比之下，工程化DNA激活剂因其简单性、可编程性和经济性而更具前景[28]。Cas12a通过dsDNA的激活依赖于原间隔区序列（PAM）。Cas12a通过其PAM相互作用域（PI）与dsDNA的PAM特异性结合。这种相互作用由Cas12a和PAM序列之间的范德华力和氢键驱动，可通过促进dsDNA分离和R环形成来诱导Cas12a的别构激活[11]、[29]、[30]。值得注意的是，缺乏PAM模块的dsDNA可能阻止Cas12a的激活，因为PAM结合是crRNA入侵和随后R环形成的前提，这使得PAM成为精确控制Cas12a切割活性的理想控制单元。现有的PAM可访问性调节策略通常依赖于昂贵的抗原-抗体修饰、复杂的引物设计以及多步骤组装、精确的化学计量平衡和外部控制元件，这些因素阻碍了该系统在广泛诊断中的应用[28]、[31]、[32]。因此，开发一种更直接、高效且可扩展的DNA激活剂工程化策略是非常必要的。

在这项研究中，我们开发了一种新的编程策略，通过酶促修复级联反应重塑dsDNA激活剂中的PAM模块来调节Cas12a。该方法不同于现有的PAM工程化策略（如基于抗体的阻断和趾爪介导的链置换），后者利用DNA修复酶作为分子开关来共价恢复功能性的PAM结构。关键突破包括：（1）将目标识别转化为dsDNA激活剂的永久性共价修饰；（2）将可编程传感与Cas12a的扩增分离，以便直接适应不同的分析物；（3）将酶促精确性与Cas12a的切割活性结合，以实现高保真度、高时间和层次化的激活。我们使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）验证了这一概念。UDG是一种经过充分研究的DNA糖基化酶，参与碱基切除修复（BER），它通过切割N-糖苷键识别并去除尿嘧啶损伤，生成一个AP位点，随后可进行水解和延伸[33]、[34]。这一酶促过程广泛应用于DNA电路和分子诊断中，用于控制DNA链的断裂和延伸。初始的发夹状dsDNA激活剂（即发夹探针1（HP1）由于缺乏完整的PAM序列而处于非活性状态。UDG特异性去除尿嘧啶碱基，破坏初始的dsDNA激活剂，随后通过KF聚合酶辅助延伸，修复dsDNA激活剂并合成具有完整PAM功能域的活性形式，从而有效激活Cas12a。这种设计实现了对Cas12a切割活性的精确时间控制，减少了脱靶效应，并提高了复杂生物环境中的信噪比。值得注意的是，整个过程可以在37°C的恒温条件下在30分钟内完成，大大简化了操作程序并减少了转换损失和潜在污染。只需简单替换发夹探针中的损伤特异性碱基，相同的Cas12a/crRNA复合物即可用于检测其他DNA修复酶（例如人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶（hAAG）），从而构建出一种可编程且通用的传感平台（即CRISPR开关）。此外，CRISPR开关可以与侧向流动分析（LFA）结合使用，实现几分钟内的快速直观检测目标分析物，适用于现场检测（POCT）。

实验片段

一锅法UDG检测

将不同浓度的UDG与50 nM HP1、0.02 U/μL APE1、0.005 U KF、15 μM dNTP、10 nM Cas12a、10 nM crRNA、300 nM FQ-Reporter和1 × NEBuffer 2混合在一个总反应体积为20 μL的试管中。混合物在37°C下孵育30分钟，期间不进行任何中间步骤、温度变化或试剂添加。

一锅法hAAG检测

将不同浓度的hAAG与50 nM HP2、0.02 U/μL APE1、0.005 U KF、15 μM dNTP、10 nM Cas12a、10 nM crRNA、300 nM FQ-Reporter和1 × NEBuffer 2混合

基于UDG工程化PAM重塑的Cas12a切割活性调节

已知Cas12a对dsDNA底物的识别依赖于PAM模块[35]。如图1A所示，为了通过控制PAM模块的可用性来调节Cas12a的切割活性，我们设计了一种含有尿嘧啶（U）碱基和3′突出端的发夹探针（发夹探针1，HP1，图S1），该探针仅包含部分PAM序列，

结论

总结来说，我们开发了一种简单高效的方法，通过重塑发夹状dsDNA激活剂中的PAM模块来直接调节Cas12a的切割活性。（1）这种方法消除了对复杂修饰（如抗体、硼酸酯和PC连接剂）的依赖，从而降低了设计和合成成本。（2）与基于“开-关-开”设计模型的传统方法不同，这种方法不需要引入额外的

CRediT作者贡献声明

张春阳：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念构思。张秋宇：方法学、实验研究。陈路遥：撰写——初稿、验证、数据管理。刘文静：撰写——初稿、方法学、实验研究。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

作者感谢国家重点研发计划（编号2024YFA1209401）和江苏省优秀博士后人才资助计划（2025ZB595）的财政支持。

张春阳博士于1999年在中国北京大学获得博士学位。1999年至2008年间，他先后在中国清华大学、美国埃默里大学、美国约翰霍普金斯大学和纽约市立大学工作。2009年，他加入中国科学院深圳先进技术研究院担任教授。2015年，他转到中国山东师范大学任职。2023年，他成为东南大学的教授。