一种用于粘度检测的近红外荧光探针及其在多发性硬化症小鼠脊髓成像中的应用

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A NIR fluorescent probe for viscosity detection and its application to spinal cord imaging in mice with multiple sclerosis

细胞微环境粘度变化与多发性硬化症（MS）密切相关，本研究设计了一种基于二甲基氨基苯并噻唑酮（CABT）的新型近红外荧光探针。该探针通过分子内单键旋转受限机制实现粘度依赖性荧光增强，在HT22细胞和LPS激活的BV2小胶质细胞中展现出高灵敏度和低背景干扰特性，并能有效检测EAE模型中脊髓炎症浸润，为MS早期诊断提供新工具。

　　

陈龙翔|敬璐|王学飞|张新月|张大奇|李俊健

中国海南省海口市海南医学院第一附属医院神经科，570102

摘要

细胞微环境的粘度作为一个关键的生物物理参数，与肿瘤、动脉粥样硬化和多发性硬化（MS）等疾病过程密切相关。MS的核心病理机制涉及神经炎症介导的髓鞘脱失和轴突退化，最终导致多系统神经功能障碍。在本研究中，我们开发了一种新型近红外荧光探针CABT（基于二甲基氨基苯-苯并噻唑染料），该探针通过分子内单键的旋转限制机制实现粘度响应的荧光增强。由于具有高选择性、深层组织穿透能力和低背景干扰特性，该探针成功应用于HT22细胞成像以及LPS激活的BV2小胶质细胞的可视化。此外，该探针还能检测实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中的炎症浸润，为MS的早期诊断和治疗提供了一种新的分子工具。

引言

近年来，MS的发病率和患病率逐渐增加[1]。它可能导致年轻人残疾、认知障碍和生活质量下降，其影响是不可逆的[2]、[3]。MS是导致年轻女性非创伤性残疾的最常见神经系统疾病之一，是一种高度复发性和致残性的中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。因此，迫切需要快速检测早期髓鞘脱失的方法，以便观察髓鞘的破坏和完整性，并为患者提供更好的治疗，这对MS的研究具有重要意义。

MS的特点是中枢神经系统的慢性炎症，病理上表现为髓鞘破坏和轴突退化[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。炎症反应会导致全身粘度升高，作为细胞微环境的关键物理参数，这会破坏代谢效率并加剧能量失衡，通过影响扩散速率和分子相互作用[14]、[15]、[16]、[17]。粘度的变化会激活小胶质细胞，促进促炎因子的释放，形成神经炎症的正反馈循环。这种炎症微环境进一步加剧蛋白质聚集和氧化损伤[18]、[19]。因此，开发一种有效的方法来可视化小胶质细胞内的粘度变化对于由神经炎症引起的MS疾病的诊断非常重要。

目前，检测粘度的方法仅限于宏观流体粘度测试，如毛细管粘度计和旋转粘度计[20]。然而，这些方法无法用于监测细胞环境中的微粘度。荧光成像技术由于其操作简便、无创性和高检测灵敏度，已成为监测体内微环境参数的核心方法[21]、[22]、[23]、[24]。其中，粘度荧光探针技术因其高灵敏度、低毒性和良好的生物相容性而脱颖而出，成为当今微观粘度检测领域最有前景的解决方案[25]、[26]、[27]、[28]、[29]。尽管现有技术具有一定的实际价值，但在实际应用中仍存在显著局限性：主流探针主要在可见光谱范围内工作，导致组织穿透深度不足且容易受到生物自荧光的干扰。在监测小胶质细胞粘度的动态变化时，这种干扰尤为明显。近红外（NIR）荧光成像具有深层组织穿透能力、低生物损伤风险和高信噪比，已成为生物医学研究中的强大可视化工具[30]、[31]、[32]。通过设计具有特定粘度响应的分子，可以可视化炎症过程中的胶质细胞粘度变化，为研究神经炎症微环境提供了一种有效的检测方法。

鉴于此，我们合理设计了一种NIR荧光探针CABT，用于监测神经元细胞炎症过程中的粘度变化。该探针通过Knoevenagel缩合反应由二甲基氨基肉桂醛和苯并噻唑盐合成，具有较长的发射波长。CABT在700 nm处表现出粘度依赖的荧光发射（图1）。在低粘度条件下，苯并噻唑单元和二甲基氨基苯基可以自由旋转，探针不会发出荧光。在高粘度条件下，由于分子旋转受限，荧光强度显著增强。此外，CABT在监测LPS诱导的小胶质细胞（BV2细胞）粘度变化方面表现出优异的成像性能，显示出其作为细胞微环境敏感生物传感器的潜力。此外，由于NIR发射的优势，CABT可以荧光成像MS小鼠脊髓中的炎症浸润。（见图1。）

部分摘录

光学分析

使用Shimadzu UV-2600分光光度计进行了紫外光谱分析。扫描波长范围设定为200–800 nm，以覆盖紫外到可见光区域，并用于检测样品的吸收特性。荧光光谱分析使用Shimadzu F-4700荧光分光光度计进行。狭缝宽度设定为5 nm，以确保准确测量样品的荧光发射强度。

结果与讨论

荧光探针分子是通过4-(二甲基氨基)肉桂醛与3-乙基-2-甲基苯并噻唑鎓碘化物在哌啶催化下的Knoevenagel缩合反应获得的。CABT是一种基于D-π-A结构的新型粘度敏感近红外荧光探针，其分子系统由以下功能模块组成：二甲基氨基苯基单元作为强电子供体（D）；苯并噻唑鎓阳离子作为电子受体（A）；以及基于丁二烯的结构（π）

结论

总之，基于苯并噻唑的荧光探针CABT已成功用于细胞微环境粘度的成像检测。通过引入丁二烯基团，共轭体系显著延长，使其能够在近红光区域发出荧光。这一修饰不仅提高了其在生物成像中的穿透能力，还改善了其整体性能。实验结果表明CABT对粘度具有极高的敏感性

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究项目得到了海南省科技专项资金、海南省重点研发项目（ZDYF2022SHFZ294，资助人：DQ.Z.）和国家自然科学基金（82260250，资助人：DQ.Z.）的支持