基于代谢工程改造产L-缬氨酸的产酸克雷伯菌高效合成L-亮氨酸的研究

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Multistep metabolic engineered Klebsiella oxytoca for efficient l-leucine production

本研究针对L-亮氨酸工业生产菌株产量不足的问题，通过多步代谢工程改造产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca），成功构建了不依赖质粒和诱导剂的工程菌株LKO-14。研究通过引入外源L-亮氨酸合成途径、优化关键基因拷贝数、改造转运系统等策略，使L-亮氨酸产量达到70.1 g/L，转化率和生产率分别为0.347 g/g和1.46 g/L/h。该研究为L-亮氨酸的工业化生产提供了高效稳定的微生物细胞工厂。

　　

在食品、饲料和医药工业领域，L-亮氨酸作为重要的支链氨基酸具有广阔的市场需求。目前工业生产主要依赖大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的发酵法，但最高产量分别仅为63.29 g/L和54.3 g/L，且存在诱导剂依赖、质粒不稳定等问题。产酸克雷伯菌因其快速生长、广底物谱和独特的α-乙酰乳酸合酶（BudB）不受反馈抑制的特性，成为极具潜力的氨基酸生产宿主。孙伟康等研究者基于前期构建的高产L-缬氨酸菌株K. oxytoca VKO-9，通过系统性代谢工程改造，成功实现了向L-亮氨酸高效合成的代谢流重定向。

本研究采用CRISPR-Cas9基因编辑技术对菌株基因组进行多位点整合，通过蛋白质纯化与酶活测定比较不同脱氢酶的催化特性，并采用分批发酵、补料分批发酵和重复补料分批发酵等发酵工艺对工程菌株进行性能评价。

3.1 引入外源L-亮氨酸合成途径实现L-亮氨酸积累

研究人员在VKO-9基因组中整合了来自谷氨酸棒杆菌的LeuA^M突变体（异丙基苹果酸合酶，IPMS），获得菌株LKO-1。随后引入大肠杆菌来源的异丙基苹果酸异构酶（IPMI）和异丙基苹果酸脱氢酶（IPMDH）编码基因EcleuCD和EcleuB，构建LKO-2。通过比较发现，来自诺卡氏菌的苯丙氨酸脱氢酶（PheDH）对α-酮异己酸具有更高催化特异性，因此用NopheDH替换原有的BsleuDH，获得LKO-3菌株，在1-L生物反应器中产量达4.73 g/L。

3.2 增强α-酮异戊酸向α-酮异己酸转化

将内源leuABCD操纵子的启动子和转录衰减区域替换为trc启动子，并引入第二拷贝CgleuA^M，构建LKO-4菌株产量提升至10.7 g/L。进一步增加EcleuB和EcleuCD拷贝数构建的LKO-5和LKO-6菌株，分别产L-亮氨酸15.3 g/L和16.0 g/L，碳流向L-亮氨酸的比例提高至52.4%。

3.3 改造L-亮氨酸转运系统并增加CgleuA^M表达

通过强化亮氨酸输出蛋白LeuE表达和敲除输入蛋白LivK，构建的LKO-8菌株产量达17.7 g/L。引入第三拷贝CgleuA^M的LKO-9菌株产量进一步提升至19.0 g/L，L-缬氨酸副产物碳流比例降至9.18%。

3.4 强化丙酮酸缩合和二羟异戊酸脱水反应

将budB启动子替换为trc启动子构建LKO-10，解决了丙酮酸积累问题。在panE位点整合第二拷贝EcilvD（编码二羟酸脱水酶，DHAD）构建LKO-11，产量提高至20.4 g/L。引入第四拷贝CgleuA^M和第二拷贝NopheDH的LKO-13菌株，在1-L反应器中产量达21.7 g/L，转化率0.368 g/g。

3.5 引入氧耐受二羟酸脱水酶提升产量

用来自变形链球菌的SmilvD（含[2Fe-2S]簇）替换对氧敏感的EcDHAD（含[4Fe-4S]簇），构建的LKO-14菌株在7.5-L生物反应器中实现70.1 g/L的L-亮氨酸产量，转化率和生产率分别达0.347 g/g和1.46 g/L/h。重复补料发酵显示菌株遗传稳定性良好，30次传代后生产性能未出现显著衰减。

该研究通过多步代谢工程策略，成功将产酸克雷伯菌从L-缬氨酸高产菌改造为L-亮氨酸高效合成细胞工厂。工程菌株LKO-14具有不依赖质粒和诱导剂、副产物少、遗传稳定等优势，其产量超越已报道的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌工程菌，为L-亮氨酸的工业化生产提供了具有应用潜力的微生物平台。研究成果发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》，为氨基酸的微生物合成提供了新的技术路径和工程案例。