《Theriogenology》：HOXA10 regulates apoptosis and expression of receptivity-related genes in bovine endometrial epithelial cells
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HOXA10基因干扰通过激活FOXO1信号通路诱导牛子宫上皮细胞凋亡，并显著下调ITGB3、ITGB6、ITGAV表达，上调MUC1表达。
王俊英|刘博静|蔡瑞|Ivan A. Riumin|Anastasiia I. Tanygina|Samson O. Adeniran|Liubov N. Rotar|彭铮
中国东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨
摘要
HOXA10是哺乳动物子宫内膜接受性的关键标记基因，在着床窗口期间子宫内膜上皮细胞中的表达显著增加。然而，HOXA10调控牛子宫内膜上皮细胞的分子机制仍不清楚。在本研究中，我们构建了针对牛HOXA10基因的RNA干扰片段，将其转染到牛子宫内膜上皮细胞中，并进行了RNA-seq分析。我们通过EdU染色、流式细胞术、RT-qPCR和Western blot来评估细胞凋亡和FOXO1信号通路。此外，还使用RT-qPCR、Western blot和免疫荧光染色来分析与接受性相关的基因（ITGB3、ITGB6、ITGAV和MUC1）的表达。结果表明，HOXA10干扰诱导了牛子宫内膜上皮细胞的凋亡变化。受影响的代谢途径包括细胞周期、细胞衰老、FOX信号通路和DNA复制。FOXO1、CDKN1A、CCND1、CDK4和BAX的表达显著上调，而CCNE1、CCNB1、CDK2和BCL-2的表达显著下调。此外，ITGB3、ITGB6和ITGAV的mRNA表达显著降低，而MUC1的mRNA表达显著增加。因此，这些发现表明HOXA10干扰激活了FOXO1通路，导致牛子宫内膜上皮细胞凋亡。
引言
HOXA10基因是同源框基因家族的关键成员，属于HOX基因簇的A簇[1]。HOX基因编码含有同源结构的转录因子，在胚胎模式形成和组织特异性分化中起重要作用。除了发育过程外，HOX基因家族的多个成员在成年生殖组织中仍表现出调控性表达，参与子宫内膜的激素依赖性重塑。其中，HOXA10在哺乳动物子宫内膜中高表达，并在调节子宫内膜结构和功能中起关键作用[2]。越来越多的证据表明，子宫内膜HOXA10的表达呈现明显的周期性模式，在着床窗口期间显著上调。这种时间调控使HOXA10能够通过调节子宫内膜上皮细胞的增殖和分化以及控制下游着床相关基因的转录来参与子宫内膜接受性的建立[[3]，[4]，[5]]。一致的是，HOXA10表达的失调与子宫功能受损、上皮-基质相互作用缺陷、不孕以及人类和动物模型中的子宫内膜病理学密切相关。
在小鼠中，HOXA10基因敲除或异常表达通常会导致着床失败[6]。同样，在不孕女性中也经常观察到HOXA10表达异常[7]。研究表明，HOXA10通过防止E-钙粘蛋白的甲基化来维持上皮细胞的极性，这一过程对成功的胚胎着床至关重要[2]。此外，HOXA10通过调节整合素β3（ITGB3）的表达直接影响子宫内膜接受性窗口的形成和胚胎粘附过程[8,9]。在反刍动物中，HOXA10的表达受孕酮调控，其表达峰值与子宫内膜接受性窗口相吻合[10,11]。特别是在牛中，该基因对子宫接受性至关重要，与VEGF协同作用促进血管生成和胚胎粘附，从而支持妊娠的建立[12,13]。在猪和牛中，HOXA10通过与Cyclin D1启动子结合来驱动子宫内膜增殖，同时通过调节Bcl-2/BAX平衡来减少细胞凋亡[[12]，[13]，[14]]。在所有哺乳动物中，HOXA10在早期胚胎着床过程中表现出显著的功能保守性[15]。这种跨物种的功能保守性突显了HOXA10在生殖生物学中的核心作用[16]。HOXA10的生物学功能通过涉及激素信号传导、生长因子、表观遗传修饰和非编码RNA的多级分子调控机制实现，这些机制在哺乳动物中既具有高度保守性又具有物种特异性的调控多样性[17,18]。因此，深入研究HOXA10的调控网络对于理解其在胚胎发育和维持妊娠中的基本作用至关重要。这样的见解也可能揭示出治疗生殖障碍的新诊断和治疗方法。
子宫内膜接受性是评估雌性动物生育能力的重要标准。它指的是在特定激素刺激时间窗口内子宫内膜的临时功能状态，在此期间囊胚可以着床并启动妊娠[19]。在牛的发情周期中，与子宫内膜接受性相关的基因表达通过卵巢类固醇激素雌二醇（E2）和孕酮（P4）的协调作用得到精确调控，从而支持胚胎发育、着床和妊娠的维持[20]。子宫内膜接受性的分子基础涉及胚胎和母体子宫内膜之间高度整合和动态的相互作用网络[21]。胚胎分泌多种信号分子、细胞因子和生长因子，从而使子宫内膜对着床敏感[22]。已经确定了几种作为子宫内膜接受性指标的生物标志物，包括HOXA10、LIF和ESR1，以及特定的基因和蛋白质，如整合素、黏蛋白和选择素，这些在子宫内膜接受性阶段都表现出显著的变化[21]。然而，在某些情况下，整合素家族等信号通路的异常激活或抑制可能导致妊娠失败或其他生殖并发症[23]。在牛产业中，子宫内膜接受性直接影响受孕率和繁殖效率，是决定牧场经济效益的重要生物学基础[24]。
RNA干扰（RNAi）是一种由小干扰RNA（siRNA）或微RNA（miRNA）介导的基因沉默机制。RNAi技术的发现为研究基因功能提供了革命性的工具[25]。同样，RNA测序（RNA-seq）是一种高通量转录组技术，可以全基因组定量基因表达。RNA-seq结合生物信息学工具（如DESeq2和edgeR）能够识别差异表达基因，并通过功能富集分析揭示生物过程的分子机制，包括基因本体（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）[26]。为了探索HOXA10调控牛子宫接受性的分子机制，本研究采用了RNAi技术在牛子宫内膜上皮细胞（BEEC）中敲低HOXA10的表达。随后进行了RNA-seq分析，以识别转录组变化并验证与HOXA10调控相关的下游分子通路。这为提高牛胚胎着床效率和增强母牛的繁殖能力提供了理论基础。
部分摘录
伦理声明
中国东北农业大学的机构动物护理和使用委员会批准了所有实验方案（NEAUEC20240232）。
试剂和化学品
Trizol?（目录号：15596026，Invitrogen，上海，中国），胎牛血清（FBS，目录号：P30-3306，PAN-Biotech，Adenbach，德国），逆转录试剂盒（目录号：RR047A，Takara，北京，中国），ROX（目录号：72986700，Roche，上海，中国），BCA试剂盒（目录号：SW101-02，Seven Biotech，北京，中国），DMEM/F12（目录号：D8437，HOXA10干扰对BEEC增殖的影响
RT-qPCR（图1A）和Western blot（图1B）的结果显示，与阴性对照组相比，si-HOXA10转染组的HOXA10 mRNA和蛋白质表达水平显著降低（P < 0.05），约降低了50%。培养48小时后的显微镜观察（图1C）显示，与对照组相比，HOXA10干扰组的细胞密度明显降低。转染细胞中出现了典型的凋亡形态特征HOXA10对BEEC增殖和凋亡的影响
作为转录调节因子，HOXA10在细胞增殖和细胞周期进展中起重要作用。在小鼠子宫内膜再生过程中，HOXA10通过激活促增殖信号通路来维持上皮稳态[31]。相反，在人类子宫内膜癌细胞的研究中显示，HOXA10的缺失会阻断G1/S期转换[14]，表明其参与细胞周期调控。结论
干扰HOXA10基因可激活FOXO-1通路，从而促进牛子宫内膜上皮细胞的凋亡。此外，HOXA10基因干扰下调整合素家族成员（包括ITGB3、ITGB6和ITGAV）的表达，同时上调MUC1的表达。
CRediT作者贡献声明
王俊英：撰写——原始草稿、方法学、概念构思。刘博静：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理。蔡瑞：可视化、研究。Ivan A. Riumin：验证、软件。Anastasiia I. Tanygina：验证、监督。Samson O. Adeniran：撰写——审稿与编辑。Liubov N. Rotar：软件。彭铮：撰写——审稿与编辑。利益声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究的财务支持来自中国国家重点研发计划（2023YFD1300602）和中国人力资源和社会保障部（D20250100）。
