《Toxicon: X》：Proteomic analysis of FACS-enriched whole nematocysts from the colonial hydrozoan
Hydractinia symbiolongicarpus
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本研究针对刺胞动物毒液系统细胞分散导致的分离难题，利用转基因水螅体(Hydractinia symbiolongicarpus)的minicollagen-1启动子驱动mScarlet-I荧光标记，通过流式细胞分选(FACS)双门控策略分离发育中和成熟刺细胞，结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术首次构建了包含8,470个蛋白质的全刺细胞蛋白质组。研究发现严格门控策略(SG)富集760个蛋白质，宽松门控策略(LG)富集165个蛋白质，通过与刺细胞富集转录组、单细胞RNA-seq数据集比较验证了刺细胞系中蛋白质富集的特异性。正交聚类分析揭示了四个刺胞动物物种间共享的77个直系同源簇以及水螅纲特有的39个簇。该研究为功能毒理学研究提供了重要资源，推进了Hydractinia作为毒液系统模型的应用。
在广阔的海洋世界中，刺胞动物（包括水母、海葵、珊瑚等）作为最古老的毒液动物谱系，其独特的"刺细胞"毒液系统一直是科学家们探索的焦点。这些散布在生物体各组织的刺细胞含有称为刺丝的微型毒液注射器，每个刺丝囊仅包含皮升级的毒素。然而，正是这种细胞分散的特性，使得刺细胞分离变得异常困难，特别是对于需要大量样本的蛋白质组学研究。
传统上，刺胞动物毒液研究面临两大技术瓶颈：一是刺细胞分布分散导致难以富集，二是成熟刺丝囊从细胞脱落后细胞质成分丢失。虽然RNA测序技术大大扩展了我们对毒液多样性的认知，但蛋白质水平的数据对于验证推定毒素的存在至关重要——因为RNA表达水平与毒液粗提物中蛋白质产品的丰度可能存在显著差异。
为了解决这些挑战，研究人员将目光投向了实验室模型生物Hydractinia symbiolongicarpus。这种殖民性水螅体具有明确的息肉类型分工：专门负责摄食的胃息肉和专门负责生殖的生殖息肉，它们展示不同的刺细胞类型。更重要的是，该物种高度适合基因组操作技术，包括转基因技术。
在这项发表于《Toxicon: X》的研究中，研究团队创新性地利用转基因技术，通过minicollagen-1（HsymNcol-1）启动子驱动mScarlet-I荧光蛋白表达，标记发育中和成熟的刺细胞。研究人员采用双流式细胞分选门控策略：严格门控策略侧重于高细胞活性，而宽松门控策略则减少细胞类型偏差以保留更多成熟刺细胞。通过液相色谱-串联质谱技术，团队对分选细胞进行蛋白质组分析，并使用两个不同的基因组注释数据库进行比对。研究还整合了单细胞RNA测序数据和正交聚类分析，从多维度验证了蛋白质组数据的可靠性。
主要技术方法
研究使用转基因Hydractinia symbiolongicarpus品系（约110个息肉），通过荧光激活细胞分选分离mScarlet-I阳性刺细胞群体，采用两种门控策略（严格门控和宽松门控）。蛋白质提取后通过液相色谱-串联质谱进行分析，使用非冗余蛋白质注释数据库。数据分析包括差异表达分析、与单细胞RNA测序数据集比较，以及通过OrthoVenn3进行正交聚类分析。
3.1. 双分选策略产生不同的蛋白质组谱
研究人员共鉴定出8,470个总蛋白质，其中2,232个可进行统计学定量。严格门控策略富集了760个蛋白质，宽松门控策略富集了165个蛋白质。与先前组装的刺丝囊富集转录组比较显示，93.7%的检测蛋白质与预测转录本匹配，表明两个数据集之间有很强的相关性。
3.2. Hydractinia全刺丝囊蛋白质组与多组学数据集的比较
与两个单细胞RNA测序数据集比较发现，9%的检测蛋白质也被鉴定为发育中和成熟刺细胞的标记基因。特别值得注意的是，严格门控策略富集的蛋白质与发育刺细胞簇有更大的重叠，包括一个推定的MACPF毒素，该毒素在单细胞图谱中特异性表达于特定的发育刺细胞簇。
3.3. Hydractinia刺丝囊蛋白质组与其他刺胞动物刺丝囊蛋白质组的比较
正交聚类分析揭示了四个刺胞动物物种间共享的77个直系同源簇，以及Hydractinia和Hydra之间特有的39个簇。共享簇富含结构蛋白、毒液和各种酶，而水螅纲特异性簇中含有更高比例的新颖蛋白质（13/39），这些可能代表了水螅纲特有的刺丝囊相关基因。
研究结论与意义
这项研究首次报道了使用流式细胞分选分离策略的刺细胞蛋白质组数据集，为刺胞动物毒液系统研究提供了重要资源。研究表明，分选门控策略的选择对实验结果有显著影响——严格门控策略虽然可能增加细胞偏差，但能鉴定更多蛋白质，特别是推定的毒素蛋白。
该蛋白质组与单细胞RNA测序数据的整合分析，揭示了刺细胞发育过程中毒液系统相关候选物的表达模式。特别是发现了一些可能特定于特定刺细胞亚型的毒素表达，如推定的MACPF样蛋白特异性表达于发育刺细胞的单个簇中，暗示其可能特定于某种形态类型（如胃息肉的小桉椽刺丝囊）。
正交聚类分析不仅确认了已知的刺丝囊结构蛋白（如minicollagen、NOWA、CPP等），还发现了大量水螅纲特异的新颖蛋白质，这些蛋白质可能与水螅纲刺细胞形态多样性相关。水螅纲拥有最丰富的刺细胞形态变异，估计有17个亚型为该类群所特有。
这项研究将Hydractinia确立为一个功能强大的比较毒理学模型系统。该物种具有完善的培养方法、染色体水平基因组组装、丰富的分子工具（转基因、基因敲除等），加上本研究提供的蛋白质组资源，使其成为研究动物毒液系统进化、生态和多样性的理想平台。随着更多功能基因组学实验的开展，科学家们将能更深入地理解刺胞动物毒液系统的分子机制和进化历程。
