《Veterinary Microbiology》：Intranasal vaccination with gB adjuvanted by poly(I:C) induces complete protection against pseudorabies virus in swine
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本研究旨在应对伪狂犬病毒（PRV）感染带来的巨大经济损失。为解决传统肌肉注射疫苗在诱导鼻黏膜免疫方面的不足，研究人员评估了鼻腔接种糖蛋白B（gB）亚单位疫苗（联合poly(I:C)佐剂）对猪的免疫保护效果。结果表明，该疫苗接种策略可引发强大的黏膜抗体反应，促进鼻腔三级淋巴结构（TLS）形成，并在面对强毒株攻击时提供完全的临床保护，显著降低组织病毒载量和病毒脱落。这为开发针对猪呼吸道病原体的新型黏膜疫苗策略提供了重要依据。
伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）是严重危害全球养猪业的重要病原体，可引起呼吸系统疾病、繁殖障碍和神经系统紊乱，造成巨大的经济损失。该病毒入侵机体的首要门户是鼻腔黏膜，感染鼻腔上皮细胞后，病毒可迅速扩散至神经系统，使得病毒清除变得极为困难。因此，鼻腔黏膜不仅是病毒的入口，更是拦截病毒感染的免疫前线。尽管目前商品化的基因缺失减毒活疫苗（如Bartha-K61株）通过肌肉注射可诱导强大的全身免疫，提供可靠的保护，但其在鼻腔黏膜局部引发的免疫活性有限，使得病毒入侵的最初部位未能得到充分防护。为了在病毒感染的最早期阶段就将其阻断，迫切需要能够有效激发局部黏膜免疫的疫苗接种策略。
蛋白质亚单位疫苗（Protein subunit vaccines, PSVs）因其靶向明确的病毒抗原，安全性高且稳定，是鼻腔递送疫苗的理想平台。作为PRV的关键包膜糖蛋白，gB负责病毒入侵宿主细胞，是重要的保护性抗原。尽管基于gB的肌肉注射亚单位疫苗已被证明能保护仔猪，但鼻腔递送gB是否能诱导有效的保护性免疫尚不清楚。此外，针对PRV的鼻腔蛋白质亚单位疫苗目前仍属空白。为了探究这一问题，并评估鼻腔黏膜免疫在防控PRV感染中的潜力，南京农业大学的研究团队在《Veterinary Microbiology》期刊上发表了最新研究成果。
研究人员开展了一项系统的动物实验研究。他们首先利用CHO-K1细胞表达系统制备了重组PRV gB蛋白。随后，将4周龄的PRV血清阴性仔猪分为五组进行实验：模拟感染组（Mock）、病毒攻击对照组（ZJ01）、肌肉注射gB疫苗组（gB i.m.）、鼻腔接种gB疫苗组（gB i.n.，使用poly(I:C)作为佐剂）以及接种商业减毒活疫苗Bartha-K61组。在初次免疫和加强免疫后，研究人员评估了血清中和抗体、局部黏膜抗体（IgA和IgG）反应。之后，所有免疫组和病毒对照组均用强毒PRV ZJ01株进行鼻腔攻击，并监测临床症状、体温、病毒脱落以及组织病理学变化。最后，收集鼻腔组织进行转录组测序（RNA-seq）分析，以探究黏膜免疫的分子机制。研究采用了免疫组织化学（IHC）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、定量聚合酶链式反应（qPCR）以及免疫荧光染色等关键技术方法。
3.1. 鼻腔PRV gB免疫为仔猪提供针对强毒PRV攻击的完全保护
免疫组织化学分析显示，鼻腔接种的gB抗原在2小时内即可被鼻黏膜上皮成功摄取，并在6小时内转运至固有层，这为后续的免疫激活提供了基础。攻击实验结果表明，鼻腔接种gB疫苗的仔猪在攻击后全部存活，体温正常，未出现明显的临床症状。与病毒攻击对照组和Bartha-K61疫苗组相比，gB i.n.组和gB i.m.组的病毒脱落量略有减少，且肺和脑组织中的病毒载量显著降低。病理学检查进一步证实，gB i.n.组和gB i.m.组的肺、脑、肝脏均未观察到明显的组织损伤，而攻击对照组和Bartha-K61组则出现了严重的炎症细胞浸润、血管周围套袖样改变和出血等病变。这些发现表明，鼻腔接种PRV gB亚单位抗原能有效预防临床疾病，减少病毒脱落，并保护组织免受病理损伤。
3.2. 鼻腔gB疫苗接种激发强烈的局部抗体反应
通过检测鼻腔拭子、鼻黏膜匀浆上清液（NMHS）和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的gB特异性抗体，研究人员比较了局部免疫反应。在攻击前，gB i.n.组在鼻腔拭子中诱导了最强的gB特异性IgG反应。攻击后，gB i.n.组在NMHS和BALF中的gB特异性IgA水平均显著高于其他组。定量免疫组化分析也显示，gB i.n.组鼻甲中IgA分泌细胞的数量显著增加。这些结果综合表明，鼻腔gB免疫在局部黏膜部位诱导了更广泛、更强大的病原体特异性抗体反应。
3.3. 鼻腔PRV gB免疫促进鼻黏膜中三级淋巴结构的形成
组织学检查发现，与模拟组、病毒攻击组、肌肉注射组及Bartha-K61组相比，gB i.n.组仔猪的鼻甲组织中出现了显著增多的三级淋巴结构。多重免疫荧光染色进一步揭示，在这些淋巴样聚集体中积累了CD19+B细胞和CD3+T细胞，并且IgA+细胞环绕在腺泡结构周围。定量分析证实，gB i.n.组鼻甲中的CD3+T细胞和CD19+B细胞数量均显著高于其他组。这些发现证明，鼻腔gB疫苗接种与增强的TLS形成以及鼻黏膜中淋巴细胞浸润增加相关。
3.4. 与鼻黏膜TLS形成相关的差异表达基因的转录组学分析
对鼻黏膜组织进行RNA-seq分析发现，gB i.n.组与模拟组相比，拥有最多数量的独特差异表达基因。KEGG（京都基因与基因组百科全书）富集分析显示，在gB i.n.组中，与TLS形成和维持相关的IL-17和TNF信号通路被显著激活。热图分析和qPCR验证进一步表明，与TLS发生相关的关键基因，如CXCL13、CCL20、IL-17F、IL-17C和IL-17RA，在gB i.n.组中表达显著上调。这些结果提示，鼻腔接种gB加poly(I:C)可能触发了TLS的形成。
研究结论与意义
本研究的核心结论是，鼻腔接种以poly(I:C)为佐剂的PRV gB亚单位疫苗，能够有效激发包括TLS形成在内的强大鼻黏膜免疫反应，从而在强毒PRV攻击下为猪只提供完全保护。与传统的肌肉注射gB疫苗或Bartha-K61减毒活疫苗相比，鼻腔免疫虽然诱导的全身性中和抗体滴度较低，但能更有效地在病毒入侵的“第一道防线”建立免疫屏障，表现为更强烈的局部抗体（特别是IgA）反应、更丰富的免疫细胞（B细胞、T细胞、IgA分泌细胞）浸润，并促进形成TLS这一局部分化性免疫反应“前哨站”。转录组学数据为TLS的形成提供了分子层面支持，显示IL-17和TNF等关键通路被激活。
该研究具有重要科学意义和转化价值。它首次系统评价了针对PRV的鼻腔蛋白亚单位疫苗的免疫保护效果，并深入揭示了其通过诱导TLS来增强局部免疫的潜在新机制，这显著增进了对猪鼻黏膜免疫的理解。在应用层面，该研究为开发安全、有效的抗猪呼吸道病原体黏膜疫苗平台提供了直接证据和新的策略方向，即通过鼻腔递送亚单位疫苗，有可能在感染早期、在病毒入侵部位就实现有效拦截，从而为更有效地控制PRV等黏膜感染性疫病带来新希望。
