《Virologica Sinica》：Integrated multiplex PCR and metatranscriptomics reveal upper-lower airway microbial landscapes in pediatric respiratory infections
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为了解决相当一部分儿童急性呼吸道感染无法明确病原体的问题，研究人员通过整合多重PCR和宏转录组学测序，系统比较了PCR阳性和阴性病例的上下气道微生物组，并关联了疾病严重程度。研究发现，PCR阴性病例具有独特的、以细菌为主的微生物特征，尤其以假单胞菌富集为标志。该研究揭示了微生物特征在采样部位和临床严重程度上的差异，为临床诊断和精准治疗提供了新见解。
在全球范围内，儿童急性呼吸道感染（ARTI）是导致婴幼儿发病和死亡的主要原因之一。据世界卫生组织统计，每年约有130万五岁以下儿童死于此类感染，其中肺炎是致死首要原因。尽管诊断技术不断进步，但准确识别呼吸道病原体仍面临巨大挑战。这主要是因为潜在的病毒和细菌病原体种类繁多，常常发生共感染，而目前常规的分子检测方法通常只能覆盖一组有限的常见病原体。因此，相当大比例的儿童急性呼吸道感染病例病因不明，临床上往往只能依赖经验性支持治疗或使用广谱抗生素，这凸显了对更全面的病原体监测策略的迫切需求。
呼吸道在解剖学上可分为上、下两部分，分别具有不同的组织结构和微生物群落。感染常起源于上气道，并可能进展至下气道，导致肺炎等更严重的病症。表征上下呼吸道感染在微生物上的差异，对早期诊断和临床管理至关重要。此外，疾病严重程度也会塑造微生物组成。比较轻症和重症病例，可以揭示与临床进展相关的特定微生物类群。同时，分析抗菌素耐药基因有助于识别新出现的耐药模式，指导经验性抗生素的使用。因此，全面评估跨解剖部位、疾病严重程度和耐药背景的微生物特征，对于提高儿科急性呼吸道感染的诊断准确性和实现靶向治疗策略至关重要。
为了应对这些关键的临床和科学难题，研究人员开展了一项针对不同年龄段住院儿童的大规模系统研究。他们采用双重策略全面分析了上呼吸道（鼻咽拭子，NS）和下呼吸道（支气管肺泡灌洗液，BALF）样本：一是使用常规多重PCR检测22种常见呼吸道病原体；二是利用宏转录组学二代测序（mNGS）研究病原体阴性病例。该研究旨在描绘已知和未确诊的急性呼吸道感染病例中的病毒和细菌谱，比较上下呼吸道感染的微生物景观，并探索微生物特征与临床疾病严重程度之间的关联。通过整合分子诊断和高分辨率测序，其研究结果为理解儿科急性呼吸道感染的呼吸道病毒组和微生物组提供了新见解，并为未来的病原体监测和精准诊断提供了有价值的框架。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：研究于2020年12月至2021年7月期间，在广州妇女儿童医疗中心招募了514名住院儿童患者，收集了505份鼻咽拭子和85份支气管肺泡灌洗液样本。首先使用针对22种目标病原体的多重PCR（RespiFinder 2SMART assay）进行病原体筛查。随后，根据PCR结果（阳性组PG和阴性组NG）对样本进行分组，每组随机抽取8个样本混合成一个池，进行宏转录组学二代测序。测序在Illumina NextSeq 550平台上进行。利用内部的IDseq流程和CLC Genomics Workbench等生物信息学工具进行数据处理、微生物分类、抗生素耐药基因注释以及统计分析。
研究结果
参与者的人口统计学和临床特征
共有514名14岁及以下被诊断为急性呼吸道感染的儿童入组，患者男女比例为1.73:1，中位年龄2.1岁。基于临床诊断，59名患者为严重肺炎，375名为肺炎，80名为其他呼吸道感染。研究还招募了24名无症状的健康儿童作为对照。
多重PCR在上、下呼吸道中识别出相似的病原体谱
对505份NS和85份BALF样本进行22靶标多重PCR检测，分别在77.0%的NS样本和54.1%的BALF样本中检出呼吸道病原体。在NS样本中，最常见的病原体是人偏肺病毒（HMPV）、人鼻病毒/肠道病毒（HRV/EV）和人博卡病毒（HBoV）。BALF样本也显示出相似的模式。共感染在阳性样本中占有一定比例。病原体分布因年龄而异，HMPV、HRV和呼吸道合胞病毒在1岁以下婴儿中占主导。在所有22种病原体中均观察到男性感染占优势。值得注意的是，仅有一份NS样本流感检测呈阳性。
系统发育分析揭示流行呼吸道病毒的主要基因型
对最主要的五种病毒病原体进行基因特异性扩增和系统发育分析，揭示了研究期间不同的基因型流行模式。HMPV毒株主要聚集在B亚型内。HRV表现出最高的多样性，基因型A最为普遍。HBoV毒株被统一归类为HBoV1。RSV毒株主要是BA.9基因型。HAdV显示出最大的基因型异质性，包括HAdV-C1、C2、C5和C6在内的多种基因型共同流行。
宏转录组测序在病原体阳性和阴性组中识别出不同的病毒图谱
根据PCR结果将临床样本分为病原体阳性组和病原体阴性组。每组内随机抽取8个样本混合进行宏转录组测序。病毒相关读段在阳性组样本中显著更丰富，而细菌读段在阴性组样本中富集。这些发现表明，病毒感染在病原体阳性病例中占主导地位，而未检出的细菌病原体可能是相当一部分病原体阴性病例的基础。最常见的病毒科包括微小核糖核酸病毒科、肺病毒科和副粘病毒科。此外，宏转录组分析还揭示了更广泛的病毒科谱。
不同病因组和解剖部位的呼吸道微生物群差异富集
对宏转录组数据集中最丰富的10个细菌属进行了比较分析，包括韦荣球菌属、鞘氨醇单胞菌属、链球菌属、假单胞菌属、代尔夫特菌属、莫拉克斯菌属、丙酸杆菌属、普雷沃菌属、嗜血杆菌属和二氧化碳嗜纤维菌属。值得注意的是，假单胞菌属在阴性和阳性组中均有检测到，但其相对丰度在阴性组中显著更高。物种水平注释表明，假单胞菌的读段主要对应于临床上常见的致病谱系。上、下呼吸道之间的微生物分布也存在差异，韦荣球菌属、链球菌属、普雷沃菌属和二氧化碳嗜纤维菌属主要在代表上呼吸道的NS样本中富集，而假单胞菌属、代尔夫特菌属和丙酸杆菌属在代表下呼吸道的BALF样本中更丰富。
在急性呼吸道感染患者中检测到抗生素耐药基因
通过将宏转录组测序读段比对到综合抗生素耐药性数据库，分析了抗生素耐药基因。共在研究的各组中检测到8个ARG。具体而言，lnuC、ermB、tetM、mel和cfxA在阳性组中被识别，而ermB和cfxA3在阴性组中检测到。在BALF来源的样本中，aph(6)-Id仅在BALF病原体阳性组中独特检出，rsmA在BALF病原体阴性组中检测到。值得注意的是，在健康对照样本中未发现耐药基因。
轻度和重度呼吸道感染之间的微生物组成差异
比较轻度和重度病例的微生物谱发现，在来自重症病例的下气道样本中，细菌读段比例显著高于轻度和重症患者的上气道样本，而病毒读段比例则显著低于轻度上气道样本。病毒组比较显示，前四大病毒科在轻度和重度病例中均被检测到。微生物组分析进一步揭示了轻度和重度病例之间存在一组共有的前10位细菌属，但相对丰度存在显著差异。值得注意的是，假单胞菌在重症病例中显著富集，而韦荣球菌在轻度感染中更为丰富。
研究结论与讨论
本研究通过结合多重PCR与宏转录组测序，提供了儿科急性呼吸道感染的整合病因学和微生物学特征。通过并行分析上、下气道样本，研究结果完善了对病原体分布的理解，突出了与未确诊感染相关的微生物特征，并强调了无偏倚测序在常规诊断中的补充价值。
与先前报告一致，HMPV、HRV和HBoV仍然是该队列中的主要病毒病原体。一个意外的观察是流感病毒检出率极低，这与COVID-19后流行模式中季节性流感持续受到抑制的情况相符。主要病毒的系统发育分析揭示了与本地和全球流行谱系一致的亚型分布，而腺病毒则表现出更广泛的基因型异质性，反映了其地方性、多谱系传播动态。
本研究的一个核心发现是PCR阴性急性呼吸道感染具有独特的微生物特征。虽然PCR阳性样本池以病毒转录本为主，但PCR阴性样本池显示出明显向细菌丰度转移的趋势，这表明一些未确诊的病例可能涉及常规PCR panel漏检的细菌性病原体。有几项观察结果支持阴性样本中假单胞菌的富集反映了真实感染而非污染。这些发现表明，假单胞菌很可能代表了PCR阴性急性呼吸道感染中有意义的细菌信号。
轻度和重度感染之间的差异进一步说明了疾病严重程度如何塑造气道微生物组。尽管主要的病毒科在两组中均存在，但重症病例呈现出向细菌富集型特征的转变，并显著富集假单胞菌，而轻度感染则显示出相对较高的病毒贡献。这一模式与先前将细菌过度生长或气道菌群失调与更严重临床表现联系起来的报告一致。
研究中还检测到一些低丰度的植物相关病毒序列，它们可能来源于饮食摄入、植物源性颗粒或环境暴露，而非真正的呼吸道感染。真菌和寄生虫生物在宏转录组数据中仅检测到极低丰度的读段，与背景水平相当，未达到预设的病原体识别阈值。由于采样时疾病阶段的异质性、儿科患者年龄相关的巨大免疫学变异性以及混合测序策略固有的局限性，宿主免疫-微生物组关联未能产生一致的模式。
本研究强调了常规多重PCR与宏转录组测序相比在儿科呼吸道感染诊断中的局限性。宏转录组测序可以全面揭示细菌、病毒、真菌、罕见病原体和未知病原体的共存情况，有助于避免广谱抗生素的滥用并促进其靶向使用，从而为制定精准抗感染治疗方案提供依据，应在临床诊断中推广。然而，它也面临着检测成本高、缺乏国际标准化操作程序以及报告时间长等挑战。未来的努力应侧重于开发用于实时病原体和耐药基因检测的快速、临床可用的宏基因组学工具。开发自动化文库制备设备、集成分析软件和人工智能辅助解读将是提高诊断特异性和实现临床转化的关键。
此外，研究人员在本地临床数据背景下回顾了抗生素耐药基因谱。尽管大多数门诊病例无法进行常规的基于培养的药敏试验，但宏转录组分析中检测到的主要ARG与医院儿科监测数据中报告的耐药模式一致。这种一致性表明，尽管缺乏个体水平的药敏相关性，检测到的ARG反映了当地的耐药生态。这些发现支持了更新当前诊断策略、改进抗菌药物使用以及推进儿科呼吸道感染精准治疗的必要性。
总之，本研究利用多重PCR和宏转录组测序全面描绘了儿科急性呼吸道感染患者的呼吸道病原体和微生物群特征。研究人员在阳性与阴性组、上下气道以及轻症与重症病例之间识别出不同的微生物特征，并发现关键类群和耐药基因与疾病严重程度相关。这些发现增进了我们对儿科呼吸道感染的理解，并支持更精准的诊断和治疗策略。
