细胞外基质通过透明质酸介导三阴性乳腺癌循环肿瘤细胞簇形成并促进转移

《Nature Communications》：Extracellular matrix mediates circulating tumor cell clustering in triple-negative breast cancer metastasis

本研究揭示了在缺乏典型上皮黏附连接的三阴性乳腺癌中，细胞外基质成分透明质酸通过与其受体CD44相互作用，介导循环肿瘤细胞在血流剪切力下形成稳定细胞簇的新机制。该研究阐明了由肌动蛋白驱动的细胞突起初始接触、HA-CD44结合启动簇集、以及后期桥粒加固的成熟过程，不仅解释了TNBC细胞的高转移特性，还为靶向CTC簇的转移干预提供了新靶点。

　　

癌症转移是导致癌症相关死亡的主要原因，而循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）作为肿瘤传播的"先头部队"，在转移过程中扮演着关键角色。值得注意的是，以细胞簇形式存在的CTCs比单个CTCs具有更高的转移能力。在上皮性肿瘤中，细胞间的稳定连接通常由上皮黏附连接（Adherens Junctions, AJs）蛋白（如E-钙黏蛋白）介导。然而，在侵袭性极强的三阴性乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancer, TNBC）中，这些AJ蛋白常常表达缺失或低下，这就提出了一个关键科学问题：这些缺乏典型细胞连接分子的肿瘤细胞是如何形成稳定的CTC簇，从而增强其转移能力的？

近日发表在《Nature Communications》上的研究给出了答案：细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）成分——透明质酸（Hyaluronan, HA）及其受体CD44，介导了不依赖于AJ的CTC簇形成。这项研究不仅揭示了TNBC细胞在血液循环中"抱团取暖"的新机制，还为理解肿瘤细胞适应性提供了新视角。

研究人员首先通过生物信息学分析发现，在TNBC肿瘤中，ECM和质膜相关基因显著富集，其中透明质酸合成酶2（Hyaluronan Synthase 2, HAS2）是基底样型乳腺癌（主要为TNBC）中最富集的ECM相关基因之一。基因集富集分析显示，HAS2相关基因与上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）、乳腺癌转移、claudin-low特征和癌症干细胞等侵袭性特征呈正相关。

为了探索HA在CTC簇形成中的具体作用，研究人员开发了一种体外肿瘤细胞簇形成实验，模拟生理水平的剪切应力条件。他们发现，转移性TNBC细胞系（如LM2、BT549、WHIM12）能快速形成稳定的多细胞簇，而非转移性乳腺癌细胞系（如MCF7、BT474）则保持单细胞状态。进一步实验证明，HA是簇形成的关键：用透明质酸酶（Hyaluronidase, HAse）降解HA，或通过短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）敲低HAS2表达，都会显著抑制TNBC细胞的簇形成能力。

机制上，研究人员发现HA介导的细胞簇形成是一个多步骤过程：首先，细胞通过肌动蛋白（actin）为基础的膜突起相互接触，HA富集于这些突起的顶端；随后，HA与CD44受体结合，启动细胞间连接；随着细胞被拉近，这些初始相互作用扩展为膜-膜接触，并最终通过桥粒（desmosomes）加固稳定。值得注意的是，这种HA-CD44相互作用是充分且必要的：在原本不形成簇的SUM159细胞中过表达HAS2，可使其获得簇形成能力；而在293FT细胞中共表达HAS2和CD44，能重构簇形成过程，但CD44结合位点突变体（CD44^R41A）则无此效果。

研究人员还发现，HA介导的簇形成不仅限于同型肿瘤细胞间，还能促进异型簇的形成。表达CD44的非肿瘤细胞（如免疫细胞）可通过与CTC表面的HA结合，被招募到CTC簇中。这种异型相互作用可能进一步增强了CTC簇的生存和转移能力。

在动物实验中，研究人员证实了HA在体内转移过程中的关键作用。与对照组相比，HAS2敲低的LM2细胞在自发转移模型和实验性转移模型中均表现出显著的转移减少。更重要的是，HAS2敲低不仅减少了CTC总数，还显著降低了CTC簇的数量和规模。

关键技术方法概述

本研究综合运用了生物信息学分析（TCGA、METABRIC数据库）、基因操作（过表达、shRNA敲低、CRISPR/Cas9敲除）、体外功能实验（簇形成实验、Matrigel侵袭实验）、活细胞成像、免疫荧光/电子显微镜、流式细胞术以及小鼠转移模型（自发转移和实验性尾静脉注射模型）。人类样本分析包括来自转移性TNBC患者的血液样本。

HA是TNBC CTC簇形成所必需的

研究人员发现，在剪切应力条件下，HA对于TNBC细胞簇的形成和稳定至关重要。虽然在不施加剪切力的情况下，HA缺失的细胞也能形成聚集，但这些聚集物在生理水平的剪切应力下迅速解离，而对照细胞形成的簇则保持稳定。电子显微镜分析显示，HA缺失的细胞聚集物中细胞间空隙更大，连接更少，表明HA能促进紧密的细胞包装和稳定的细胞间连接。

HA-CD44相互作用足以诱导肿瘤细胞簇形成

通过受体阻断实验和基因操作，研究人员证实HA-CD44相互作用是簇形成的核心机制。CD44抗体（IM7）处理能显著减少肿瘤细胞簇形成，而CD44敲除细胞则完全丧失簇形成能力。在重构实验中，共表达HAS2和野生型CD44（而非突变型CD44^R41A）足以使非簇形成细胞（如293FT）获得簇形成能力。

基于肌动蛋白的细胞突起是肿瘤细胞簇形成所必需的

免疫荧光分析显示，HA富集于肌动蛋白为基础的细胞突起顶端，这些突起是细胞间初始接触的"探针"。肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin A处理能消除突起形成并抑制簇形成，而微管聚合抑制剂colchicine则无此效果，表明肌动蛋白细胞骨架在HA介导的簇形成中起关键作用。

突起的滑动使得细胞连接成熟

活细胞成像和电子显微镜分析揭示了簇形成的动态过程：细胞首先通过尖端富集HA的突起建立接触；随后这些突起沿着彼此滑动，逐渐增加细胞间接触面积；最终形成大面积的膜-膜接触，并通过桥粒加固。这种成熟过程与上皮AJs的形成有相似之处，但基于不同的分子机制。

HA促进簇在剪切应力下的稳定性

时间进程实验显示，HA缺失的细胞在剪切应力下存活率显著降低，活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平升高。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）能部分挽救HA缺失细胞的死亡，表明HA介导的簇形成通过减少氧化应激来增强细胞在循环中的存活。

HA是体内CTC簇形成和转移所必需的

在自发转移模型中，HAS2敲低显著减少了肺转移负荷，而不影响原发瘤生长。重要的是，HAS2敲低 drastically降低了血液中CTC总数和CTC簇数量。在实验性转移模型中，预形成的HAS2敲低细胞簇在肺定植能力也显著降低，证实了HA在转移级联后期的作用。

HA促进CTCs与非CTCs之间的相互作用

研究人员还发现，HA能作为"对接平台"，招募表达CD44的非肿瘤细胞（如免疫细胞）进入异型CTC簇。在患者样本和小鼠模型中，均观察到HA在CTC与中性粒细胞等免疫细胞相互作用位点的富集，这种异型相互作用可能进一步增强了CTC簇的免疫逃逸和转移能力。

研究结论与意义

本研究揭示了ECM成分HA在TNBC转移中的新功能——介导不依赖于AJ的CTC簇形成。这种细胞-ECM-细胞的相互作用机制，使缺乏上皮连接分子的TNBC细胞能够形成稳定的CTC簇，从而增强其在循环中的存活能力和转移潜力。该机制不仅解释了TNBC的高转移特性，也为开发针对CTC簇的转移干预策略提供了新靶点。

值得注意的是，HA介导的簇形成机制与传统的AJ介导的簇形成既有相似之处（如依赖于肌动蛋白细胞骨架和逐步成熟的连接过程），又有重要区别（如基于ECM-受体的可塑性连接）。这种可塑性可能使HA介导的CTC簇更容易适应循环中的机械应力，从而更有效地完成转移过程。

此外，HA介导的异型簇形成能力，表明肿瘤细胞能利用这种机制"劫持"宿主细胞，形成有利于转移的微环境。这种机制可能不仅限于TNBC，也可能存在于其他缺乏上皮特征的侵袭性癌症中。

总之，这项研究深化了我们对CTC生物学的理解，揭示了ECM在癌症转移中的主动作用，为开发针对转移前播散的新型治疗策略提供了理论基础。