Nrf2去SUMO化修饰通过减轻心肌铁死亡缓解小鼠心肌缺血再灌注损伤

《Redox Report》：Nrf2 de-SUMOylation alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI) by attenuating myocardial ferroptosis in mice

本综述聚焦于心肌缺血再灌注损伤（MIRI）这一关键临床问题，深入探讨了Nrf2蛋白在K110位点的SUMO化修饰如何通过上调转铁蛋白受体（Tfr）表达加剧心肌细胞铁死亡，而该位点的去SUMO化（由Senp1催化）则能通过下调Tfr、上调铁蛋白（ferritin）和Slc7a11表达，减轻铁死亡，从而对MIRI发挥保护作用。研究揭示了Nrf2 SUMO化修饰在MIRI中的致病新机制，为靶向该通路治疗缺血性心脏病提供了潜在新策略。

　　

3.1. Nrf2 K110R小鼠在正常条件下与野生型小鼠无明显差异

为探究Nrf2去SUMO化的体内作用，研究利用CRISPR/Cas9技术构建了对应人类NRF2 K110R突变的Nrf2 K110R小鼠模型。在正常条件下，Nrf2 K110R小鼠与野生型同窝小鼠在体重、摄食量以及主要器官（包括心脏、肝脏、脾脏、胸腺、肾脏、肺、白色和棕色脂肪组织）的形态和重量上均无显著差异。组织学检查也未发现两者器官形态存在差异。这些结果表明，在基础状态下，Nrf2 K110位点SUMO1修饰的缺失不影响小鼠的正常生理状态。

3.2. Nrf2 K110R小鼠的心脏形态和功能与野生型小鼠无差异

通过苏木精-伊红（HE）染色和超声心动图进行的组织学分析显示，Nrf2 K110R小鼠与野生型同窝小鼠在心脏形态和功能上无差异。此外，RNA测序数据表明，Nrf2 K110R小鼠心脏的基因表达谱与野生型对照相比没有显著改变。这些结果共同证明，在正常条件下，Nrf2 K110位点SUMO1修饰的缺失不影响心脏形态和功能。

3.3. Nrf2去SUMO化可保护小鼠免受心肌缺血再灌注损伤

为阐明Nrf2去SUMO化在MIRI中的作用，研究对8周龄雄性小鼠进行了左冠状动脉前降支结扎诱导缺血的手术。在闭塞1小时并再灌注24小时后，超声心动图检查显示，Nrf2 K110R小鼠的左心室射血分数（EF%）和左心室短轴缩短率（FS%）均优于野生型小鼠。同时，伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑（TTC）染色显示，Nrf2 K110R小鼠的危险区（AAR）内梗死面积小于野生型小鼠。这些结果证实，Nrf2 SUMO1修饰的缺失可以减轻小鼠的MIRI。

3.4. Nrf2去SUMO化可通过减轻心肌铁死亡来缓解心肌缺血再灌注损伤

尽管Nrf2的去SUMO化不影响其在MIRI过程中的表达水平，但研究发现，与野生型小鼠相比，Nrf2 K110R小鼠心脏中Nrf2的SUMO化水平显著降低，脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）的含量也显著减少。同样，铁死亡标志物前列腺素内过氧化物合酶2（Ptgs2）的心脏mRNA表达水平在MIRI后的Nrf2 K110R小鼠中呈下降趋势。随后对心肌组织中总铁、Fe²⁺和Fe³⁺水平的评估显示，Nrf2 K110R小鼠心脏中的总铁和Fe²⁺水平显著低于野生型小鼠。这些发现表明，Nrf2 K110R小鼠的MIRI组织中铁死亡严重程度降低，这可能归因于Nrf2 SUMO1修饰的缺失。与此一致，蛋白质印迹和实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析表明，在MIRI期间，与野生型小鼠相比，Nrf2 K110R小鼠心脏组织中Tfr的mRNA和蛋白表达水平降低，而铁蛋白（ferritin）和Slc7a11的mRNA和蛋白表达水平升高，Ho-1和Gpx4的表达则保持稳定。这反映了Nrf2 K110R小鼠心脏中铁摄取减少和铁储存增强。综上所述，这些结果表明Nrf2去SUMO化可通过减轻心肌铁死亡来对抗MIRI。

3.5. 使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1可减轻由Nrf2 SUMO化加剧的心肌缺血再灌注损伤

为了进一步研究Nrf2 SUMO化通过铁死亡加剧MIRI的作用，研究对经历MIRI手术的Nrf2野生型和K110R小鼠使用了铁死亡抑制剂Liproxstatin-1。结果显示，接受Liproxstatin-1治疗一周后，Nrf2野生型和K110R小鼠在MIRI期间的功能差异被消除。这反映了Nrf2 SUMO化可能通过增强心肌铁死亡而加剧MIRI。

3.6. Nrf2 SUMO化通过上调Tfr表达加剧RSL₃诱导的H9C2细胞铁死亡

为阐明Nrf2 SUMO化加剧心肌细胞铁死亡的潜在机制，研究使用了Senp1野生型和敲除的H9C2细胞进行实验。如前所述，Senp1敲除导致SUMO化的Nrf2显著积累。这些细胞随后用铁死亡诱导剂RSL₃以剂量依赖性方式处理。结果表明，Senp1缺陷使H9C2细胞对RSL₃诱导的细胞死亡更加敏感。此外，在RSL₃诱导的铁死亡过程中，Senp1敲除导致H9C2细胞脂质过氧化（LPO）水平升高。在机制上，Senp1敲除与H9C2细胞在RSL₃处理后Tfr表达水平升高相关，这与在Nrf2 K110R小鼠体内发现的mRNA水平变化相似。总之，这些发现表明，Nrf2 SUMO化可通过上调Tfr表达加剧RSL₃诱导的心肌细胞铁死亡。

4. 讨论

本研究在先前研究的基础上，利用Nrf2 K110R小鼠模型，探讨了Nrf2去SUMO化在MIRI中的作用。结果表明，由Senp1促进的Nrf2去SUMO化可通过减轻心肌细胞铁死亡来缓解MIRI。值得注意的是，体内给予铁死亡抑制剂Liproxstatin-1减弱了Nrf2野生型和K110R小鼠在MIRI中的差异，突显了铁死亡在Nrf2 SUMO化加剧MIRI中的关键作用。

虽然已知Nrf2活性受多种翻译后修饰调控，包括磷酸化、乙酰化和泛素化，但它们在MIRI相关铁死亡中的作用仍具有背景依赖性且尚未完全阐明。本研究发现，在保守的K110位点的SUMO化是一个将Nrf2与心肌细胞铁代谢和铁死亡直接联系起来的具体调控层面。与全局性的Nrf2激活或抑制可能同时影响众多抗氧化和解毒途径不同，K110的去SUMO化似乎优先调控参与铁处理的一部分Nrf2靶基因，最显著的是Tfr。这种选择性可能解释了为何观察到Tfr和铁蛋白的显著变化，而Ho-1表达没有随之改变。

Ho-1是Nrf2的一个著名靶基因，可促进血红素水解并增加游离铁离子浓度。Nrf2/Ho-1通路的激活与心肌细胞铁过载和随后的铁死亡有关。然而，在本研究中，未检测到Nrf2野生型和K110R小鼠心脏中Ho-1表达水平的显著差异。铁蛋白是另一个受Nrf2调控的基因，编码一种铁储存蛋白，可调节铁死亡和心肌病。本研究发现，在MIRI期间，Nrf2 K110R小鼠心脏中铁蛋白表达水平更高，反映了这些心脏铁储存能力增强，可能减少心肌细胞内游离铁的可用性，从而减轻铁死亡。此外，Nrf2 K110R小鼠心脏中Tfr表达水平降低，表明这些细胞铁摄取减少。Tfr已被确定为一种重要的铁死亡标志物，可促进铁进入细胞，从而通过增加细胞内铁水平来加剧铁死亡。这些数据共同支持了Nrf2去SUMO化可通过减轻心肌铁死亡来缓解MIRI的结论。

先前研究表明，Senp1可通过HIF1α依赖性通路保护免受MIRI。本研究中，使用具有Nrf2 SUMO化积累的Senp1缺陷型H9C2心肌细胞，发现Senp1缺失使H9C2细胞对RSL₃诱导的铁死亡更加敏感。在机制上，Senp1缺失导致H9C2细胞在RSL₃处理后Tfr表达水平显著升高，这可能是由积累的SUMO化Nrf2转录诱导的。这些体外发现与小鼠心脏组织中的观察结果一致。

本研究存在一些局限性。首先，仅使用了雄性小鼠，这可能限制了研究结果对雌性的普适性。其次，H9C2细胞系来源于大鼠，而体内模型是小鼠，这可能导致一些差异。第三，研究聚焦于Tfr，但Nrf2 SUMO化可能调控其他铁死亡相关基因。最后，Nrf2去SUMO化对MIRI后心脏重塑的长期影响值得进一步研究。

总之，虽然Nrf2 SUMO1修饰可增强Nrf2转录活性和抗氧化防御，但它可通过上调Tfr表达促进心肌细胞铁死亡，从而加剧MIRI。靶向Nrf2 SUMO化通路或增强其去SUMO化为治疗缺血性心脏病提供了新的潜在策略。