《Acta Tropica》：Development and implementation of droplet digital PCR assays for accurate quantification of
Plasmodium vivax parasitemia and G6PD viangchan genotyping
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本研究针对间日疟原虫(Plasmodium vivax)血症精准定量和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD) Viangchan变异分型的临床需求，开发了双靶标微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法。研究显示，该技术对P. vivax血症检测限达3.2寄生虫/μL，定量限为400寄生虫/μL，准确度>90%；G6PD分型灵敏度与特异性均达100%。该方法成功应用于泰国临床样本监测，为疟疾精准治疗和用药安全评估提供了可靠技术支撑。
在热带地区的公共卫生领域，疟疾始终是挥之不去的阴影。根据世界卫生组织最新报告，2023年全球仍有2.63亿疟疾病例，其中间日疟原虫(Plasmodium vivax)在东南亚地区尤为猖獗。泰国边境省份近年来病例数呈现上升趋势，给当地医疗系统带来持续压力。
面对这一挑战，临床治疗面临双重难题：一方面需要准确评估患者血液中的寄生虫载量以监控治疗效果，另一方面在使用根治药物时必须警惕葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症带来的溶血风险。特别是在东南亚地区，G6PD Viangchan变异株最为流行，该变异被世界卫生组织归类为B类（酶活性低于正常值45%），使用伯氨喹等药物可能导致严重溶血反应。
传统显微镜检测虽成本低廉但依赖操作者经验，实时荧光定量PCR(qPCR)又需要标准曲线进行定量，这些方法在精准医疗时代已显不足。正是在这样的背景下，朱拉隆功大学临床显微镜系的研究团队将目光投向了微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)技术，这种技术能够实现核酸分子的绝对定量，无需标准曲线即可获得精确的拷贝数数据。
该研究发表于《Acta Tropica》杂志，团队成功开发了两种双靶标ddPCR检测体系：一个针对P. vivax微管蛋白(tubulin)基因和人类RHCE基因，用于寄生虫绝对定量；另一个针对G6PD Viangchan变异(871G>A)，实现精准基因分型。研究采用泰国甘烹碧省的临床样本进行验证，通过方法学优化、线性范围考察以及与显微镜检查、桑格测序等金标准对比，全面评估了新方法的性能。
主要技术方法
研究团队设计了特异性引物和探针，其中寄生虫定量检测使用HEX标记的微管蛋白基因探针和FAM标记的RHCE基因探针，G6PD分型检测则采用分别针对野生型和突变型等位基因的双色探针系统。实验使用QX200微滴生成系统和T100热循环仪进行ddPCR分析，通过对29份全血与干血斑样本、46份临床样本的平行检测，以及与显微镜检查和桑格测序结果的对比，验证方法可靠性。
3.1. ddPCR检测方法的优化
研究人员通过温度梯度实验确定了最佳退火温度：寄生虫定量检测为51°C，G6PD分型检测为65.6°C。二维振幅图显示微滴簇分离清晰，寄生虫定量检测中成功区分出阴性（灰色）、RHCE基因阳性（蓝色）、微管蛋白基因阳性（绿色）和双阳性（橙色）微滴群体。G6PD分型检测在女性杂合子样本中显示出野生型和突变型等位基因的均衡扩增，浓度分别为191 copies/μL和187 copies/μL。
3.2. ddPCR检测的线性、精密度和准确度
通过5倍系列稀释实验，寄生虫定量检测在1:1至1:125稀释范围内保持稳定，寄生虫密度在9035-10327/μL之间。人类RHCE基因(R2=0.9606)和P. vivax微管蛋白基因(R2=0.9956)均呈现优异线性关系。该方法检测限(LOD)为3.2寄生虫/μL，定量限(LOQ)为400寄生虫/μL，此时准确度大于90%，变异系数(CV)低于20%。G6PD分型检测在系列稀释中也保持良好线性(突变型R2=0.9947，野生型R2=0.9996)。
3.3. 间日疟原虫寄生虫定量方法的比较分析
全血与干血斑样本的ddPCR检测结果呈正相关(R2=0.4248)，全血与显微镜检查结果相关性更高(R2=0.6000)。全血样本的RHCE基因浓度(平均175.4 copies/μL)显著高于干血斑样本(平均9.1 copies/μL)，比例达30.7倍，表明全血DNA得率更高，但比率计算方法有效减少了这种差异对寄生虫定量的影响。
3.4. ddPCR检测G6PD基因分型的灵敏度和特异性
与桑格测序相比，ddPCR在25份样本中表现出100%的一致率，灵敏度与特异性均达到100%，成功鉴定出4例半合子男性、2例杂合子女性和19例野生型样本。
3.5. 双靶标ddPCR检测在临床样本中的应用
46份临床样本的寄生虫密度范围为315-82,429 parasites/μL，平均12,449 parasites/μL。治疗监测显示，氯喹治疗后第1天寄生虫减少45.3-91.3%，第2天减少99.2-99.9%，第3天完全清除。91份样本的G6PD分型显示，98.9%为野生型，仅发现1例杂合子女性携带Viangchan变异。
研究结论与意义
这项研究建立的ddPCR检测平台为疟疾管理提供了双重解决方案：一方面通过寄生虫精准定量助力治疗监测和耐药性评估，另一方面通过G6PD快速分型保障用药安全。特别是将人类RHCE基因作为内参的创新设计，有效校正了不同样本类型(DNA提取效率差异对定量结果的影响，使全血与干血斑检测结果具有可比性。
该方法检测灵敏度高达3.2寄生虫/μL，能够有效监控治疗过程中低密度寄生虫感染，为评估药物疗效提供了可靠工具。尽管目前仅针对G6PD Viangchan变异，但技术平台可扩展至其他常见变异检测，为东南亚地区疟疾精准防治提供技术支撑。
研究团队也指出了一些局限性，如样本量相对有限、未覆盖其他常见G6PD变异等。未来工作可进一步扩大检测范围，优化流程以降低成本，推动这一技术在实际医疗场景中的应用。总体而言，该研究为疟疾的分子诊断和个体化治疗提供了创新性解决方案，展现了ddPCR技术在热带传染病精准医疗中的应用前景。
