《Bioactive Materials》：Pre-priming cell sheet therapy enabled by dynamic wrinkled electroactive substrate for muscle reconstruction
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本研究针对大块肌肉缺损修复中细胞聚集密度不足和外源细胞功能激活难题，开发了一种基于近红外响应动态褶皱导电基底的预激活细胞片疗法。该平台可无创收获高密度、具有机电生物活性的细胞片，在体外和体内均显著促进肌生成分化、生长和促再生钙信号，为先进细胞疗法和可兴奋组织的修复提供了新策略。
在战场、事故、外科手术或退行性疾病中，人体骨骼肌有时会遭遇毁灭性的打击，导致大块组织缺失，这就是Volumetric muscle loss。面对这种损伤，肌肉自身的再生能力往往捉襟见肘。虽然临床上功能性的游离肌肉移植是“金标准”，但它也带来了供区损伤、手术复杂和神经再支配不可靠等重重挑战。传统的细胞注射疗法，细胞像撒出去的种子一样容易流失；而静态的生物材料支架，又难以复现肌肉那充满生机的原生微环境。那么，有没有一种方法，能像“播种秧苗”一样，将大量功能完备的细胞整体移植到损伤部位，并让它们快速“扎根生长”，重建肌肉功能呢？
这项发表在《Bioactive Materials》上的研究，正是为了回答这个问题。研究人员巧妙地将材料科学与细胞工程结合，设计了一种智能的细胞培养“温床”——一种能对近红外光响应的、表面布满动态褶皱的导电基底。这个神奇的“温床”不仅能大规模培养细胞，还能在近红外光的远程操控下，像开关一样精准地控制细胞的粘附与脱离，从而实现细胞片的高质量、无创伤收获。更重要的是，这个基底本身具备导电性，能模拟肌肉组织的电生理特性，在细胞培养阶段就对它们进行“预激活”，让它们在移植前就具备更强的功能。最终，将这种“预激活”的细胞片移植到大鼠肌肉缺损模型中，显著促进了肌肉的功能性再生。这项研究不仅为治疗VML等难治性肌肉损伤提供了新策略，更强调了“工程设计界面动态”而非仅依赖静态材料性质，对于开发先进细胞疗法的核心重要性。
研究人员开展此项研究主要运用了以下几项关键技术：首先，他们通过原位聚合在掺有碳纳米管的聚二甲基硅氧烷弹性体基底上制备了聚吡咯导电薄膜，构建了具有动态褶皱结构的双层功能复合材料。其次，利用原子力显微镜、扫描电镜、接触角测量仪和导电原子力显微镜等对材料表面形貌、润湿性及导电性进行了系统表征。第三，通过调控近红外激光照射，系统研究了材料的光热响应性能（温度变化、循环稳定性）及其诱导的表面褶皱动态重构行为。第四，在细胞层面，研究人员使用了包括C2C12成肌细胞、L6成肌细胞和原代心肌细胞在内的多种可兴奋细胞模型，通过活死染色、CCK-8增殖实验、免疫荧光染色、钙瞬变记录及RNA测序等方法，全面评估了电活性褶皱表面对细胞行为、功能成熟及分子机制的影响。第五，在动物模型验证阶段，研究建立了大鼠胫骨前肌VML损伤模型，将预处理的L6细胞片进行移植，并通过组织学染色、免疫荧光及肌肉湿重比分析等手段，在术后1周和4周评估了肌肉再生、血管新生及炎症反应等修复效果。
2.1. 近红外光响应动态褶皱电活性表面的开发及其光热响应特性
研究人员成功构建了一种智能双层系统。该系统以掺有碳纳米管的PDMS为基底，通过原位聚合在其表面形成聚吡咯导电薄膜。由于两层材料力学模量和热膨胀系数不匹配，聚合过程自发诱导形成了分级的褶皱结构。原子力显微镜表征显示，随着聚合时间增加，表面从光滑状态演变为无序的迷宫状褶皱图案，其宽度、高度和粗糙度在8小时后达到饱和。该复合材料在近红外光照射下，嵌入的碳纳米管能高效地将光能转化为热能，引发基底的热膨胀，从而动态改变上层Ppy薄膜的褶皱形貌。这种形貌切换可逆且稳定，通过简单地开关近红外光，就能实现表面在细胞粘附状态与非粘附状态间的可编程转换。在优化的参数下，材料在磷酸盐缓冲液中可稳定维持在约37°C的生物相容温度，为后续无创细胞收获奠定了基础。
2.2. 近红外光响应动态褶皱电活性表面对可兴奋细胞的多功能生物活性增益
该电活性表面为可兴奋细胞提供了优越的微环境。细胞活死染色和增殖实验表明，C2C12成肌细胞在PDMS/CNTs-Ppy表面的粘附和生长密度与组织培养塑料相当，优于无Ppy的对照组。更重要的是，利用原代心肌细胞作为生物指示剂的研究发现，培养在导电PDMS/CNTs-Ppy表面的心肌细胞表现出强而同步的钙瞬变信号和肉眼可见的自发收缩，而在非导电的PDMS/CNTs-PLA表面则只有微弱、异步的信号。免疫荧光显示，导电表面上的心肌细胞表达更高水平的连接蛋白43和肌节α-辅助动蛋白，表明其电耦合和收缩结构更成熟。RNA测序分析进一步揭示，与在非导电表面培养的C2C12细胞相比，在电活性表面培养的细胞其差异表达基因显著富集于“肌肉系统过程”、“肌肉收缩”、“肌肉细胞分化”等与骨骼肌再生密切相关的通路。这些结果证实，褶皱电活性表面通过提供电学和拓扑学联合刺激，有效促进了可兴奋细胞的功能成熟。
2.3. 基于可调粘附/去粘附的近红外光响应动态褶皱电活性表面实现无损伤细胞片收获
该平台的核心优势之一是能够无创、完整地收获细胞片。细胞通过整合素介导的粘附机制与基底结合，形成黏着斑。研究发现，在近红外光刺激下，基底褶皱的动力学重构会在细胞-基底界面产生机械应力。这种应力变化引发了一系列协调的细胞响应：机械感受器整合素β1和踝蛋白在细胞周边聚集，而黏着斑激酶的活化形式pFAK表达下降，黏附蛋白纽蛋白的表达也减少，表明成熟的黏着斑结构主动解聚。同时，机械敏感转录共激活因子YAP/TAZ发生核转位。这一系列分子事件改变了力的平衡，使得细胞驱动的收缩力克服了基底粘附力，从而导致细胞从照射区域特异性、程序化地脱离。重要的是，此过程不引起DNA损伤，且完全保留了细胞间的连接和细胞自身分泌的细胞外基质。收获的C2C12和L6细胞片面积大、结构完整，细胞骨架和细胞连接蛋白保持完好。
2.4. 动态褶皱电活性表面制备的细胞片的体内治疗潜力
为验证治疗潜力，研究将预处理的L6细胞片移植到大鼠胫骨前肌VML模型中。术后1周和4周的评估显示，细胞片移植组的修复效果显著优于细胞悬液移植组和单纯损伤组。组织学染色表明，细胞片组在损伤区域形成了更密集、更成熟的新生肌纤维，纤维化沉积显著减少。肌肉湿重比分析也显示细胞片组的肌肉质量恢复更接近假手术组。免疫荧光检测快肌肌球蛋白重链显示，细胞片组有更多具有收缩功能的快肌纤维生成。这些结果证明，预激活的、高完整性的细胞片能更有效地促进骨骼肌的实质性再生和功能恢复。
2.5. 细胞片通过增强血管生成促进骨骼肌损伤修复
血管再生是组织修复的关键。研究发现，细胞片移植在早期就显著促进了损伤部位的血管新生。术后1周，细胞片组血管性血友病因子阳性的微血管和α-平滑肌肌动蛋白阳性小动脉的密度均显著高于其他组。体外实验证实，从电活性表面培养的细胞片上收集的条件培养基，能显著增强人脐静脉内皮细胞的迁移和成管能力。这表明细胞片通过其旁分泌功能，主动释放促血管生成因子，为损伤部位的修复创造了富血管化的有利环境。到术后4周，随着修复完成，新生血管密度在各组间趋于一致，说明细胞片主要促进了修复早期关键的血运重建。
2.6. 骨骼肌修复机制与炎症评估
研究还探讨了细胞片治疗的免疫调节机制。通过检测巨噬细胞标志物CD86和CD206，发现细胞片移植能够调控损伤局部的免疫微环境。在修复早期，细胞片组表现出更高的M2型抗炎巨噬细胞与M1型促炎巨噬细胞的比值。体外实验进一步证明，从电活性表面培养的细胞片获取的条件培养基，能诱导RAW264.7巨噬细胞向M2表型极化。RNA测序分析也提示，电活性基底能激活与伤口愈合正调控相关的通路，同时抑制促炎信号。这些证据表明，电活性微环境及其支持的细胞片，能够通过旁分泌信号引导巨噬细胞向促修复的抗炎表型极化，从而减轻慢性炎症，为组织再生创造有利条件。
3. 结论
本研究成功开发了一种基于近红外光响应动态褶皱电活性基底的预激活细胞片疗法，用于治疗VML。该智能平台能够通过基底形貌的可编程重构，以无创方式收获保留完整细胞连接和细胞外基质的高质量细胞片。其作用机制在于，近红外光触发的褶皱动力学变化在细胞-基底界面诱导了精准的机械应力，引发整合素β1、踝蛋白等机械感受器募集，随后pFAK活性降低、纽蛋白表达下降，从而程序化地解聚黏着斑，实现细胞片温和脱离。同时，导电且具有微结构的表面通过钙信号等通路，为C2C12成肌细胞提供了电学和机械的联合刺激，显著促进了其肌源性分化和电生理成熟，实现了细胞的功能预激活。在动物模型中，移植的L6细胞片展现了多方面的协同修复作用：保持的细胞间连接和旁分泌功能有效减轻了炎症、促进了早期血管新生；预激活的细胞增强了骨骼肌再生通路的活化；电活性微环境引导了巨噬细胞向M2表型极化，优化了组织重塑。综上所述，这项工作不仅为VML的再生修复提供了一种高效、整合的新策略，更重要的是，它确立了“工程设计界面动态”而非仅仅依赖静态材料属性，对于发展下一代先进细胞疗法的核心原则。这种动态电活性基底策略，在可兴奋组织再生领域具有广阔的应用前景。
