《Cancer Letters》：LINC01978 Drives Perineural Invasion in Cholangiocarcinoma Through Tumor-Neural Crosstalk and CCL2-Mediated Macrophage Recruitment
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本研究揭示胆管癌（CCA）肿瘤源性外泌体LINC01978通过激活神经细胞GDNF分泌和RET/STAT3通路促进神经侵袭（PNI），同时巨噬细胞分泌CTSB降解神经周围ECM形成双循环机制，临床数据显示LINC01978高表达与PNI及预后不良显著相关。
李浩然|周润禾|王雪蕾|孙兆伟|马凯|张炳远|王秦蕾|冯传|周斌|冯玉杰
青岛大学附属医院肝胆胰外科，中国青岛市江苏路16号
摘要
神经周围侵袭（PNI）是胆管癌（CCA）侵袭性和预后不良的重要因素。然而，肿瘤细胞、周围神经系统以及肿瘤微环境（TME）中的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）之间的相互作用机制尚未完全阐明。通过体外和体内模型研究，我们发现肿瘤来源的外泌体LINC01978能够介导神经重编程和TAM相关的细胞外基质（ECM）重塑。临床队列分析进一步证实，高水平的LINC01978表达与PNI和较差的生存率显著相关。这一机制通过免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）在人类样本中得到了验证。从机制上讲，我们提出了一种神经耦合的双循环模型来解释CCA中的PNI现象：在第一循环中，肿瘤来源的外泌体将LINC01978传递给神经细胞，通过自分泌的胶质细胞系衍生神经营养因子（GDNF）信号通路促进神经突起生长，进而激活CCA细胞中的RET/STAT3信号通路，从而促进恶性表型。在这一循环建立后，第二循环在侵袭前沿发挥作用，被侵袭的神经分泌CCL2，优先招募CCR2+炎症单核细胞（IMs）到PNI部位，这些单核细胞分化为TAMs并分泌CTSB以降解神经周围的ECM。这两个循环依次作用并相互加强，形成一个自我放大的过程，加剧了PNI的发生。
引言
胆管癌（CCA）是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤，治疗反应性差且预后不良[1]。神经周围侵袭（PNI）指的是肿瘤细胞沿神经浸润或侵入神经外膜、神经周膜或神经内膜。通常定义为肿瘤侵犯了至少三分之一的神经周长。PNI是CCA的显著特征，大约75%的病例中存在这种情况[2]。我们之前的研究发现，PNI与CCA的术后复发和不良预后密切相关[3]。因此，需要更深入地了解其机制，并寻找可行的治疗靶点以帮助患者。
CCA的进展受到肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）之间动态相互作用的影响。TME包括基质细胞和血管细胞、免疫细胞、神经纤维、细胞外基质（ECM）以及可溶性介质[4],[5]。最新研究表明，神经系统是TME的活跃组成部分，而不仅仅是被动观察者。通过细胞间信号网络，神经元素可以影响肿瘤行为和局部免疫反应[6],[7],[8],[9],[10]。然而，神经系统如何在CCA微环境中主动调节肿瘤行为和免疫反应以促进PNI仍不清楚。
长链非编码RNA（lncRNAs）是长度超过200个核苷酸的转录本，能够调控多种生理和病理过程，包括转录和翻译、细胞周期调控以及干细胞多能性[12]。外泌体是由大多数细胞类型通过内吞途径产生的40–150纳米的细胞外囊泡，它们通过运输DNA和RNA等遗传物质来介导细胞间通讯[13],[14]。我们之前的研究表明，肿瘤来源的LINC01812可以被外泌体包裹并作为细胞间信使发挥作用，通过这种机制，LINC01812促进M2型巨噬细胞的极化并最终诱导CCA中的PNI[15]。
炎症单核细胞（IMs）会被招募到受损的神经中，并分化为支持组织重塑的巨噬细胞[16]。CCR2是一种关键的趋化因子受体，负责调控单核细胞的招募[17]。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境中的主要免疫成分，占浸润细胞的50%以上[18],[19]。在TME中，巨噬细胞可以通过旁分泌信号促进PNI，并与高度侵袭性的癌细胞共同侵入神经鞘[20],[21]。
在本研究中，我们描述了一种以神经为中心的相互作用机制：神经细胞内化肿瘤来源的外泌体LINC01978后，会增加胶质细胞系衍生神经营养因子（GDNF）的分泌，激活RET/STAT3信号通路，增强CCA细胞的侵袭性。随后，被侵袭的神经产生CCL2，招募炎症单核细胞（IMs），这些单核细胞分化为高表达CTSB的巨噬细胞，破坏神经周围的ECM。这两个循环依次作用并相互强化，形成一个自我放大的过程，加剧了PNI的发生。
患者和样本
CCA样本及其匹配的邻近非肿瘤组织来自青岛大学附属医院肝胆外科接受治疗的患者。所有参与者均提供了书面知情同意书，研究方案已获得青岛大学医学伦理委员会的批准（批准编号：QYFY WZLL 30819）。
细胞培养
本研究中使用的所有细胞系均购自美国类型培养收集中心（Manassas, VA）。HIBEpiC
外泌体促进CCA中的神经周围侵袭
为了研究外泌体在CCA神经周围侵袭（PNI）中的作用，我们从QBC939和HuCCT1细胞的培养基（CM）中分离出外泌体（图1A-C）。将背根神经节（DRG）细胞培养三天，并用外泌体（5 μg/mL）处理。使用PKH26染料标记外泌体，PBS作为对照。培养24小时后，外泌体被DRG细胞成功内化（图1D）。通过在12孔板中共同培养CCA细胞和DRG细胞，建立了体外PNI模型。
讨论
CCA的特征是纤维化程度高、去胶质化的TME，由基质细胞、免疫细胞、内皮细胞和其他支持性成分组成[43],[44]。尽管神经细胞不是该环境的主要组成部分，但它们对CCA有重要的间接影响[45]。长期以来，PNI一直被认为是CCA的关键病理特征和独立的预后决定因素[46]。然而，PNI如何促进肿瘤发生的具体机制尚不清楚。
作者贡献声明
张炳远：撰写——初稿；监督。
王秦蕾：撰写——初稿。
冯传：撰写——初稿。
周斌：监督。
冯玉杰：监督；资金获取。
李浩然：撰写——审稿与编辑；撰写——初稿。
周润禾：撰写——初稿。
王雪蕾：撰写——初稿。
孙兆伟：撰写——初稿。
马凯：监督
伦理声明
人类CCA样本的收集和使用已获得青岛大学附属医院的伦理委员会批准，所有操作均在其监督下进行。所有参与者均签署了知情同意书。动物实验也获得了青岛大学附属医院的动物伦理委员会批准（批准编号：20250228C576J12020250603228）。
利益冲突
作者声明本研究不存在任何可能被视为利益冲突的商业或财务关系。
声明
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT来改进语言表达。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。
资助
本研究得到了山东省自然科学基金（ZR2023MH317）、青岛大学附属医院2024年度青年研究基金（QDFYQN2024107）、中关村精准医学基金会（GXZDH36）和湖北陈小平科学技术发展基金会（CXPJJH124001-2448）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
不适用。
