《Current Plant Biology》：Precision Editing Without Footprints: Advancing Transgene-Free Systems in Plants
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本综述系统分析植物无转基因（Transgene-free）基因组编辑技术的最新进展，重点聚焦核糖核蛋白（RNP）组分优化、递送系统创新及分子工具包开发三大核心方向。通过对比Cas蛋白变体（如SpCas9-NRRH、SpRY）与gRNA设计策略（如环状gRNA、截短sgRNA），阐释了如何提升编辑效率并降低脱靶效应；详细评述了PEG-Ca2+介导、基因枪递送、纳米材料平台及病毒载体等无转基因递送系统的优势与局限；同时引入高频再生模块（如GRF4-GIF1）、负筛选系统（如ALS基因编辑）及自消除CRISPR（TKC）等分子工具，为多年生作物育种提供多维度技术路径。本文不仅整合关键技术突破，更为解决递送效率、监管壁垒及公众接受度等挑战提供了清晰路线图。
精准编辑的无痕之道：植物无转基因系统进阶
引言
传统CRISPR/Cas系统依赖外源DNA递送，导致转基因残留引发的生物安全与监管隐患。无转基因编辑技术通过直接递送预组装核糖核蛋白（RNP）复合物或瞬时表达编辑元件，在实现精准基因组修饰的同时彻底避免外源基因整合。该技术尤为契合多年生作物（如果树、林木）育种需求，因其长生命周期难以通过杂交分离转基因成分。
Cas蛋白工程：拓展靶向范围与特异性
野生型SpCas9受限于NGG原型间隔序列毗邻基序（PAM），而新开发的SpCas9变体（如SpRY、SpG）可识别非经典PAM序列（如NG、NAAH），将水稻中的编辑效率提升至52.1%~100%。蛋白小型化是另一优化方向：通过AlphaFold2辅助设计，迷你化Cas13d（如mini-RfxCas13d）在保留编辑效率的同时，更易被纳米载体包载。核定位信号（NLS）优化亦关键，例如4×NLS-Cas9的核转运效率较无NLS版本提升10倍，显著增强编辑活性。
gRNA设计策略：平衡效率与特异性
引导RNA的稳定性与结构直接影响编辑效果。截短sgRNA（14 nt）可降低脱靶率，但可能牺牲切割活性；环状gRNA（cgRNA）通过Tornado系统成环，抗核酸酶降解能力增强，在哺乳动物细胞中实现32.6倍荧光信号提升。此外，5′端添加胞嘧啶延伸的“安全锁gRNA”（safeguard gRNA）可调控Cas9活性，兼容CRISPRa/i系统，为植物精准调控提供新工具。
无转基因递送系统：多路径突破技术瓶颈
- 1.
PEG-Ca2+介导法：将RNP复合物导入原生质体，已在胡萝卜、野生番茄中成功获得无转基因编辑植株，四倍体材料中编辑等位基因可稳定遗传。
- 2.
基因枪递送：优化金粉粒径（0.6 μm）与轰击参数（1,800 psi）后，大豆iPB-RNP系统突变率可达4.6%，并拓展至落叶松等林木体系，首次实现针叶树无转基因编辑。
- 3.
纳米材料平台：碳纳米管（CNT）可靶向递送质粒至叶绿体；层状双氢氧化物（LDH）纳米片携带siRNA沉默靶基因表达达70%；改性碳点（MCD）穿透种皮后自降解，避免转基因残留。
- 4.
病毒载体：烟草脆裂病毒（TRV）携带超紧凑TnpB酶在拟南芥中实现8.9%编辑效率，番茄斑萎病毒（TSWV）在辣椒中突变率高达77.9%，且后代无病毒残留。
高频再生分子工具包：破解再生难题
再生效率低下是难转化物种的主要瓶颈。过表达发育调节因子（如GRF4-GIF1融合蛋白）可显著提升植株再生能力：小麦未成熟胚再生率从15%增至92%，柑橘21天即可萌发编辑芽苗。细胞分裂素通路调控亦关键，B型拟南芥响应调节因子（ARR1/10）过表达使愈伤组织芽再生率提高3倍。这些模块与RNP系统联用，可大幅缩短育种周期。
无转基因筛选系统：高效追踪编辑成果
- 1.
可视化标记：RUBY报告基因产生肉眼可见的甜菜红素，替代荧光蛋白，适用于大豆等背景荧光强的作物；内源性状标记（如编辑BpGLK1诱导叶片黄化）实现无外源基因的表型追踪。
- 2.
负筛选系统：编辑乙酰乳酸合酶（ALS）基因赋予除草剂抗性，通过氯磺隆处理快速淘汰非编辑株。
- 3.
自消除CRISPR：TKC系统在完成编辑后自动删除转基因元件，水稻T1代无转基因植株比例达100%；香蕉中利用FLP/FRT重组系统实现编辑后载体自切除。
展望
尽管无转基因编辑技术在效率与通用性上仍面临挑战（如顽固物种递送效率低、多倍体基因组编辑盲区），但人工智能驱动的Cas蛋白设计、仿生智能递送载体及实时追踪技术（如CRISPR LiveFISH）正推动该领域向可预测、可调控的精准育种新时代迈进。
