《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Benzo(a)pyrene disrupts EP300-mediated epigenetic regulation of HSPA1A to alter membrane tension and promote EMT-associated migration and invasion in lung cancer cells
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本研究针对环境致癌物苯并(a)芘(B(a)P)促进肺癌转移的分子机制不明确的问题，通过体外实验发现B(a)P通过下调EP300表达，降低H2BK5ac乙酰化水平，进而抑制内吞相关基因HSPA1A的转录表达，最终导致细胞膜张力降低、上皮-间质转化(EMT)及迁移侵袭能力增强。该研究首次揭示了EP300-H2BK5ac-HSPA1A调控轴在连接环境暴露与肺癌细胞生物力学特性改变中的关键作用，为防治B(a)P驱动的肺癌转移提供了新靶点。
在当今工业化快速发展的背景下，环境污染物对人类健康的威胁日益凸显。其中，苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene, B(a)P)作为一种典型的多环芳烃类化合物，广泛存在于汽车尾气、烟草烟雾、烧烤食品和工业排放物中，已成为无法避免的环境暴露物质。流行病学研究明确显示，B(a)P暴露水平与肺癌发病率和死亡率呈显著正相关，但其中的具体分子机制尚未完全阐明。肺癌作为全球癌症相关死亡的首要原因，其进展不仅涉及局部生长，更关键的是远处转移，后者是治疗失败和患者死亡的主要原因。因此，探究B(a)P促进肺癌转移的分子机制，对于制定有效的预防和治疗策略具有重要的公共卫生意义。
细胞迁移和侵袭能力依赖于细胞前缘的粘附动力学和肌动蛋白细胞骨架的重塑，而这些分子事件可能受到细胞膜表面张力的制约。膜张力变化在细胞迁移和侵袭中扮演着关键角色，特别是在癌细胞的播散和转移过程中。研究表明，细胞膜并非信号转导的被动支架，而是细胞骨架动力学和细胞极性的关键调节器。这些发现提示，膜张力变化可能通过调节细胞骨架的组装和解聚来影响细胞迁移能力。
EP300是一种重要的组蛋白乙酰转移酶(Histone Acetyltransferase, HAT)，通过催化组蛋白乙酰化修饰来调控基因表达，在多种癌症的发生发展中起关键作用。近年来，越来越多研究阐明了EP300在肺癌播散和转移中的具体分子机制，特别是其通过组蛋白乙酰化修饰影响肺癌细胞迁移和侵袭能力。作为组蛋白乙酰转移酶，EP300调节包括H2BK5乙酰化(H2BK5ac)在内的组蛋白修饰，影响基因表达和细胞表型转换。研究表明，EP300的乙酰化活性在上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)过程中发挥重要调控作用，而H2BK5ac与上皮表型的维持密切相关，二者共同调控EMT。H2BK5ac通过促进上皮细胞表型相关基因的表达，在上皮特性维持中起重要作用。尽管大量研究探讨了EP300在肿瘤播散和转移中的调控作用，但EP300介导的组蛋白乙酰化修饰轴仍不清楚。
本研究旨在阐明苯并(a)芘暴露促进肺癌细胞恶性进展的表观遗传机制，特别关注EP300-H2BK5ac-HSPA1A调控轴，并考察其与细胞膜表面张力改变和上皮-间质转化(EMT)这两个癌细胞迁移和侵袭关键过程的关联。相关研究成果发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》期刊上。
为开展此项研究，研究人员主要运用了几项关键技术方法：使用人肺腺癌细胞系A549和肺鳞癌细胞系SW900及其基因修饰衍生细胞进行实验；通过荧光寿命成像显微镜(FLIM)技术利用Flipper-TR荧光探针精确测量细胞膜张力；采用划痕实验和Transwell侵袭实验评估细胞迁移和侵袭能力；通过蛋白质印迹法(Western Blot)和免疫荧光染色分析EP300、H2BK5ac、EMT标志物及内吞相关分子的表达变化；利用染色质免疫共沉淀测序(ChIP-Seq)和实时定量PCR(qPCR)技术研究H2BK5ac的基因组分布及其靶基因调控；通过免疫共沉淀(Co-IP)验证EP300与H2BK5ac之间的直接相互作用。
3.1. B(a)P暴露降低膜表面张力，增强肺癌细胞的迁移、侵袭和EMT
研究人员通过Flipper-TR荧光寿命成像显微镜(FLIM)技术发现，B(a)P处理以剂量依赖方式显著降低A549和SW900细胞的膜表面张力。形态学分析显示，两种细胞均发生上皮-间质转化(EMT)，细胞随着B(a)P浓度增加呈现伸长形态并伸出伪足。划痕实验和Transwell侵袭实验结果表明，B(a)P显著增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力。蛋白质印迹法和免疫荧光染色进一步证实，B(a)P引起上皮标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达下降，间质标志物N-钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达上升，明确诱导了EMT过程。
3.2. B(a)P暴露下调EP300表达和H2BK5ac水平，改变内吞相关分子表达
蛋白质印迹分析显示，B(a)P以剂量依赖方式降低EP300和H2BK5ac在肺癌细胞中的表达水平。免疫荧光染色结果支持了这一发现。ChIP-Seq分析表明，H2BK5ac在全基因组范围内广泛结合，特别是在转录起始位点(Transcription Start Site, TSS)附近±3kb区域内富集，提示其在转录调控中的重要作用。KEGG富集分析发现，H2BK5ac结合的启动子区域基因显著富集于"内吞作用"等通路。qPCR和蛋白质印迹实验证实，B(a)P下调内吞相关基因HSPA1A、HSPA1B、HSPA1L和AP2S1的表达。免疫共沉淀实验验证了EP300与H2BK5ac之间存在直接相互作用。
3.3. EP300过表达通过增加H2BK5ac和内吞相关分子减轻B(a)P诱导的效应
研究发现，在A549和SW900细胞中过表达EP300可显著提高EP300和H2BK5ac水平。在B(a)P暴露条件下，EP300过表达部分恢复了内吞相关分子的表达，增加了膜表面张力，逆转了EMT形态变化，并抑制了细胞的迁移和侵袭能力。蛋白质印迹和免疫荧光分析显示，EP300过表达上调E-钙粘蛋白，下调N-钙粘蛋白和波形蛋白，表明其能够逆转B(a)P诱导的EMT过程。
3.4. EP300敲低降低H2BK5ac水平，但恢复内吞相关分子可抑制膜张力降低和EMT
EP300敲低显著降低了EP300和H2BK5ac水平。ChIP-qPCR分析显示，EP300敲低后H2BK5ac在HSPA1A启动子区域(P1和P2)的富集程度降低。在EP300缺陷细胞中过表达HSPA1A可部分恢复膜张力，逆转EMT进程，并降低细胞的迁移和侵袭能力。这些结果表明，HSPA1A过表达能够部分挽救EP300敲低引起的恶性表型。
研究结论与讨论部分强调，环境污染物B(a)P是一种强效致癌物，其暴露与肺癌的发展和进展密切相关，特别是通过诱导EMT促进细胞恶性转化。本研究揭示了EP300-H2BK5ac轴在调节肺癌细胞膜张力、迁移、侵袭和EMT中的关键作用，为理解B(a)P诱导肺癌进展的机制提供了新见解。
近年来研究表明，膜张力在细胞生物学功能中起关键作用，特别是在肿瘤细胞迁移和侵袭中。膜张力可通过影响细胞形状变化和运动性来调控细胞行为。例如，高质膜(Plasma Membrane, PM)张力可通过抑制膜曲率感应蛋白来限制癌细胞迁移和侵袭。本研究发现在肺癌细胞中，B(a)P暴露降低膜张力，显著增强其迁移和侵袭能力并促进EMT过程，这与现有文献一致。
本研究揭示B(a)P暴露导致H2BK5ac水平降低及其靶组蛋白乙酰转移酶EP300的下调。与以往认为EP300促进EMT和癌症进展的观点不同，近期证据表明EP300通过抑制EMT和维持细胞粘附来发挥肿瘤抑制作用。免疫共沉淀实验证实了EP300与H2BK5ac的相互作用，支持这些分子共同调控关键细胞过程的假设。ChIP-Seq分析进一步探讨了EP300-H2BK5ac轴与膜张力和肿瘤细胞迁移侵袭等细胞功能的关系。
研究发现，基于通路水平分析，内吞作用相关基因在H2BK5ac结合区域中富集，提示H2BK5ac与内吞相关过程之间存在潜在机制关联。先前研究报道，内吞相关机制有助于维持膜张力和抑制癌细胞侵袭。qPCR和蛋白质印迹结果验证了B(a)P暴露下调肺癌细胞内吞关键分子HSPA1A、HSPA1B、HSPA1L和AP2S1的表达。这些分子与内吞相关过程和膜运输有关，而膜运输与先前研究中膜张力和细胞运动性的调控相关。
EP300作为组蛋白乙酰转移酶，不仅调控H2BK5ac，还调控许多其他组蛋白乙酰化修饰。这些修饰在可能影响膜张力、EMT进展和癌细胞迁移侵袭的各种细胞通路中至关重要。多项研究强调了EP300在这些过程中的多方面作用。EP300乙酰化EMT关键转录因子Snail，稳定Snail并促进肺癌细胞EMT和转移。EP300还乙酰化组蛋白H3的赖氨酸9、14和18，这对染色质重塑和EMT相关基因(如TWIST1和Snail1)的转录激活至关重要。EP300还通过组蛋白乙酰化参与MYC表达的调控。
总之，本研究确定了H2BK5ac-HSPA1A轴作为B(a)P诱导肺癌进展的关键介质，通过调控膜张力、EMT以及细胞迁移和侵袭。这些发现突出了靶向该通路在预防和治疗肺癌转移方面的潜力。未来研究应探索更广泛的EP300介导的乙酰化通路及其在对抗环境污染物诱导肺癌中的临床意义。
