《Environmental Research》：Contribution of AhR-mediated activation of the AC/cAMP/PKA cascade to 6PPDQ-induced cardiac defects in zebrafish
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AhR激活通过上调adcy6a促进心脏AC/cAMP/PKA通路，PKA介导CREB磷酸化激活AP-1促进fas/faslg过表达，导致凋亡和心脏功能障碍。
作者：翟梦雅、李金豪、张明轩、杨新月、甘倩倩、江艳、陈涛
中国苏州大学苏州医学院附属第一医院，教育部老年疾病与免疫学重点实验室
摘要
6PPDQ（N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-p-苯二胺醌）的生态和健康风险引起了广泛关注。我们最近发现，芳烃受体（AhR）介导了6PPDQ引起的外源性细胞凋亡和心脏缺陷；然而，其背后的分子机制尚未完全阐明。在本研究中，我们观察到抑制蛋白激酶A（PKA）能有效减轻6PPDQ对斑马鱼幼体造成的细胞凋亡和心脏功能障碍。后续实验显示，暴露于6PPDQ的斑马鱼胚胎心脏中的PKA水平和环腺苷一磷酸（cAMP）浓度显著升高。值得注意的是，通过药物抑制或基因敲低AhR可以消除6PPDQ诱导的PKA过表达。双荧光素酶报告基因实验表明，6PPDQ激活AhR会直接增强adcy6a的转录，该基因编码主要在斑马鱼心脏中表达的腺苷酸环化酶（AC）亚型。抑制β-肾上腺素受体并未显著影响AC/cAMP/PKA级联反应。此外，6PPDQ暴露会诱导cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化，这一效应可以通过抑制PKA得到缓解。激活的CREB随后会促进Fos的表达，Fos是激活蛋白-1（AP-1）转录因子家族的组成部分。抑制Fos（AP-1）可以抵消6PPDQ诱导的fas和faslg的过表达以及随之而来的外源性细胞凋亡。
引言
N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-p-苯二胺醌（6PPDQ）是抗氧化剂6PPD（N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-p-苯二胺的氧化产物，广泛用于轮胎和其他橡胶产品中（Chen等人，2023年）。6PPDQ存在于多种环境介质中，包括室内和室外空气、灰尘、河流、雨水径流和深海沉积物（Cao等人，2022年）。在中国广州，道路和停车场灰尘中的6PPDQ浓度范围为3.2至80.9 ng/g（Huang等人，2021a）。在美国西雅图，城市径流中的6PPDQ浓度高达19 μg/L，远超过银鲑鱼的中位致死浓度50%（LC50）（0.95 μg/L）（Tian等人，2021年，2022年）。在中国南部的一项研究中，从三个不同群体（成人、儿童和孕妇）的尿液样本中检测到6PPDQ，其中孕妇的浓度高达2.91 μg/L（Du等人，2022年）。这一水平明显高于成人（0.4 μg/L）和儿童（0.076 μg/L）（Du等人，2022年）。此外，最近的研究表明，6PPDQ的胎盘转移率高于6PPD，提示其可能对胚胎发育构成风险（Zhao等人，2023年）。
作为脊椎动物胚胎发育过程中最早形成的器官，心脏特别容易受到环境毒素的影响（Zhang等人，2021年；Adaku等人，2022a，2022b）。已有充分证据表明，母亲接触环境因素可能导致先天性心脏缺陷（CHDs），这些缺陷占所有重大先天异常的约三分之一，并是新生儿死亡的主要原因（Zhang等人，2021年；van der Linde等人，2011年；Yuan等人，2023年）。我们团队和其他团队的研究将6PPDQ暴露与斑马鱼幼体的心脏缺陷联系起来，但具体分子机制仍不清楚（Varshney等人，2022年；Zhang等人，2023年；Jiang等人，2024年）。
芳烃受体（AhR）是一种进化上保守的配体激活的转录因子，是重要的环境传感器。研究表明，AhR在心脏发育中起着关键作用（Wang等人，2013年；Carreira等人，2015年）。我们最近发现，AhR激活介导了6PPDQ引起的心脏缺陷和心肌细胞衰老（Jiang等人，2023年；Fu等人，2024年）。在非活性状态下，AhR作为热休克蛋白90、p23、XAP2和Src组成的复合物的一部分存在于细胞质中（Rothhammer和Quintana，2019年；Larigot等人，2018年）。激活后，AhR在importin α/β的协助下从细胞质转移到细胞核，并通过与靶基因启动子中的外源性反应元件（XRE）位点结合而作为配体激活的转录调节因子发挥作用。除了基因组作用外，激活的AhR还参与非基因组途径，作为E3泛素连接酶或通过酪氨酸激酶Src磷酸化多种靶蛋白（Vázquez-Gómez等人，2018年；Opitz等人，2023年）。
环腺苷一磷酸（cAMP）是由腺苷三磷酸（ATP）通过腺苷酸环化酶（AC）产生的重要细胞内第二信使（Yan等人，2016年）。cAMP的大部分效应由cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）介导，PKA是一种特征明确的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（Yan等人，2016年）。在非活性状态下，PKA是由两个调节亚单位和两个催化亚单位组成的稳定异四聚体。cAMP与调节亚单位结合后，释放催化亚单位，从而磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和其他靶蛋白。磷酸化后的CREB与其共激活因子CREB结合蛋白（CBP）相互作用，促进下游基因的转录（Zhang等人，2020年；Keshwani等人，2015年）。AC/cAMP/PKA级联反应在心脏功能中起着关键作用（Bedioune等人，2024年）。尽管已知AhR可以激活这一途径，但其确切机制仍不清楚（Ni等人，2024年；Du等人，2005年）。
我们假设6PPDQ激活AhR通过直接上调adcy6a的转录来触发AC/cAMP/PKA级联反应。PKA介导的CREB磷酸化随后通过AP-1促进fas和faslg的过表达，从而导致外源性细胞凋亡和心脏缺陷。
实验方法
化学物质
我们从河南佳轩生物技术公司（中国衡阳）购买了6PPDQ（CAS 2754428-18-5）。Importazole（IPZ，CAS 662163-81-7）、SQ22536（SQ，CAS 17318-31-9）、H-89二盐酸盐（H89，CAS 127243-85-0）、666-15（CAS 1433286-70-4）和T52224（CAS 530141-72-1）从TargetMol公司（中国上海）获得。强效的芳烃受体拮抗剂1,3-二氯-5-[(1E)-2-(4-氯苯)乙烯基]-苯（PDM2，CAS 688348-25-6）从AbMole公司（中国上海）获得。
PKA激活促进6PPDQ引起的心脏功能障碍
我们首先证明，2 μg/L和10 μg/L的6PPDQ显著降低了斑马鱼的心跳率和心输出量（图1A）。此外，AO染色显示暴露于2 μg/L和10 μg/L 6PPDQ的斑马鱼幼体心脏区域出现显著的凋亡体增加（图1B）。因此，后续实验选择了2 μg/L的6PPDQ。
如图1C和D所示，6PPDQ引起的心脏功能障碍表现为心跳率降低、心输出量减少和QT/RR间隔延长
讨论
由于6PPDQ的广泛存在和对某些水生物种的高毒性，其生态和健康风险引起了广泛关注。特别是我们最近的研究表明，暴露于2 μg/L的环境相关浓度的6PPDQ会导致斑马鱼幼体出现心脏功能障碍（Jiang等人，2024年）。然而，6PPDQ的作用机制仍不完全清楚。PKA是心血管稳态的主要调节因子，发挥着重要作用
作者贡献声明
翟梦雅：撰写初稿，进行研究。
李金豪：进行研究。
张明轩：进行研究。
杨新月：进行研究。
甘倩倩：进行研究。
江艳：撰写、审稿与编辑，监督，资金筹集。
陈涛：撰写、审稿与编辑，监督，项目管理，概念构思。
资助
本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：81870239）和江苏省高等教育机构优先学术发展计划的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的财务利益或个人关系。
